DB33/T2333—2021

飼料中β-胡蘿卜素的測定

高效液相色譜法

1范圍

本標準規(guī)定了飼料中β-胡蘿卜素的高效液相色譜測定方法。

本標準適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、添加劑預(yù)混合飼料中β-胡蘿卜素的測定。

本標準配合飼料、濃縮飼料、精料補充料的定量限為1mg/kg，添加劑預(yù)混合飼料定量限為2mg/kg。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T20195動物飼料試樣的制備

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

試樣中β-胡蘿卜素經(jīng)堿溶液超聲皂化，生成全反式β-胡蘿卜素，經(jīng)石油醚萃取，減壓濃縮后，用

高效液相色譜法測定，外標法定量。

5試劑或材料

5.1除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。

5.2水：GB/T6682-2008，一級。

5.3甲醇：色譜純。

5.4異丙醇：色譜純。

5.5二氯甲烷：色譜純。

5.6石油醚（沸程30℃～60℃）。

5.7正己烷

5.8無水硫酸鈉。

5.9乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）。

5.102,6-二叔丁基對甲酚（BHT）。

5.11L-抗壞血酸乙醇溶液：稱取L-抗壞血酸0.5g，加4mL水加熱溶解，用無水乙醇稀釋至100mL混

勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

5.1250%氫氧化鉀溶液：稱取氫氧化鉀50g，加水100mL溶解，混勻。

5.13飽和氯化鈉溶液：先將燒杯中的水煮沸，向沸水中邊攪拌邊加入氯化鈉，直到有固體顆粒析出，

將此溶液冷卻至室溫。

5.14標準儲備溶液（500μg/mL）：稱取全反式β-胡蘿卜素標準品（CAS：7235-40-7，純度不低于

95%）50mg（精確至0.01mg）至100mL棕色容量瓶中，加入10mL二氯甲烷（5.4）溶解，用二氯甲烷

（5.4）稀釋并定容至刻度，混勻，每次臨用前按附錄A標定。-20℃保存，有效期2個月。

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5.15標準中間溶液（100μg/mL）：精確移取β-胡蘿卜素標準儲備溶液（5.13）10.0mL于50mL棕色

容量瓶中，加入二氯甲烷（5.4）稀釋并定容。于4℃保存，有效期為1周。

5.16標準系列溶液：精確移取適量β-胡蘿卜素標準中間溶液（5.14）于100mL棕色容量瓶中，用流動

相稀釋定容配成系列標準溶液，濃度分別為0.0μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、5.00μg/mL、

10.00μg/mL。臨用現(xiàn)配。

5.17微孔濾膜：0.45μm，有機系。

6儀器設(shè)備

6.1高效液相色譜儀：配有紫外檢測器/二極管陣列檢測器。

6.2分析天平：感量分別為0.001g和0.01mg。

6.2超聲波清洗器。

6.3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

6.4旋渦儀。

6.5分光光度計。

7樣品

按GB/T20195制備試樣，至少200g，粉碎使其全部通過0.42mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入磨

口瓶中，避光保存，備用。

8試驗步驟

警示——應(yīng)避光操作！

8.1皂化

平行做兩份試驗。稱取試樣配合飼料、精料補充料、濃縮飼料2g～5g或添加劑預(yù)混合飼料0.2g～

1g，精確至0.001g，置于250mL具塞棕色三角瓶，加入EDTA（5.8）1g，邊搖邊加入L-抗壞血酸乙

醇溶液（5.10）50mL使試樣完全分散、浸濕，加入10mL50%氫氧化鉀溶液（5.11），混勻，50℃水浴

加熱超聲皂化20min，不時振蕩防止試樣粘附在瓶底和瓶壁上，皂化結(jié)束后取出迅速冷卻至室溫。

8.2提取

將皂化液轉(zhuǎn)移至盛有80mL石油醚（5.5）的500mL分液漏斗中，用30mL～50mL水分2次～3

次沖洗棕色三角瓶并入分液漏斗，旋緊瓶塞，輕輕振蕩，放氣，靜置分層。轉(zhuǎn)移水相至另一分液漏斗中，

加入60mL石油醚（5.5）重復提取兩次，棄去水相，合并三次石油醚相。用100mL飽和氯化鈉溶液（5.12）

洗滌石油醚提取液一次，輕輕旋搖防止乳化，棄去水相；再用水洗滌石油醚提取液至中性。石油醚提取

液過無水硫酸鈉（5.7）過濾脫水，轉(zhuǎn)移至放有幾粒BHT（5.9）的250mL棕色容量瓶中，用石油醚（5.5）

定容，搖勻。

8.3濃縮

從石油醚提取液（8.2）中（V）分取一定體積（V1）于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器燒瓶中，置于40℃±2℃減壓濃

縮至近干，殘渣用流動相5.00mL（V2）復溶解，使每毫升含β-胡蘿卜素10μg以下，旋渦混勻，用0.45

μm濾膜（5.16）過濾備用。

8.4測定

8.4.1色譜條件

8.4.1.1色譜柱：SB-C18柱，柱長250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5.0μm，或性能相當者。

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8.4.1.2流動相：甲醇+異丙醇+二氯甲烷=80+17+3。

8.4.1.3流速：1.5mL/min。

8.4.1.4柱溫：30℃。

8.4.1.5進樣量：20μL。

8.4.1.6檢測波長：450nm。

8.4.2標準系列溶液和試樣溶液測定

在儀器的最佳條件下，分別取標準系列溶液（5.15）和試樣溶液（8.3）上機測定。β-胡蘿卜素標

準溶液的液相色譜圖見附錄Ｂ。

8.4.3定性

以保留時間定性，試樣溶液中β-胡蘿卜素保留時間應(yīng)與標準系列溶液中β-胡蘿卜素的保留時間一

致，其相對偏差在±2.5％之內(nèi)。

8.4.4定量

以β-胡蘿卜素標準系列溶液中的濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線

的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.999。試樣溶液與標準溶液中β-胡蘿卜素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍

內(nèi)，如超出線性范圍，應(yīng)將試樣提取液用流動相稀釋（稀釋倍數(shù)n）至線性范圍內(nèi)，重新測定。單點校

準定量時，試樣溶液中β-胡蘿卜素的濃度與標準溶液濃度相差不超過30%。

9試驗數(shù)據(jù)處理

9.1計算

試樣中β-胡蘿卜素的含量以質(zhì)量分數(shù)計。多點校準按公式（1）計算，單點校準按公式（2）計算：

CVV1000

W2n……………………（1）

V1m1000

式中:

W——試樣中β-胡蘿卜素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

C——從標準曲線查得的試樣溶液中β-胡蘿卜素的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V——試樣提取溶液的總體積，單位為毫升（mL）；

V1——旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時所用試樣提取液的體積，單位為毫升（mL）；

V2——旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后復溶液的體積，單位為毫升（mL）；

m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；

n——超出線性范圍后，需要進一步稀釋的倍數(shù)。

ACVV1000

Ws2n……………（2）

AVm1000

s1

式中：

W——試樣中β-胡蘿卜素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

A——試樣溶液中β-胡蘿卜素的峰面積；

AS——標準溶液中β-胡蘿卜素的峰面積；

CS——標準溶液中β-胡蘿卜素的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V——試樣提取溶液的總體積，單位為毫升（mL）；

V1——旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時所用試樣提取液的體積，單位為毫升（mL）；

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V2——旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后復溶液的體積，單位為毫升（mL）；

m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；

n——超出線性范圍后，需要進一步稀釋的倍數(shù)。

9.2結(jié)果的表示

測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

10精密度

在重復性條件下，兩次獨立測定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差值不大于該算術(shù)平均值的10%。

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附錄A

（規(guī)范性）

標準儲備溶液濃度標定方法

取β-胡蘿卜素標準儲備溶液(濃度約為500μg/mL)10μL,注入含3.0mL正己烷（5.6）的比色皿中,

混勻。比色皿厚度為1cm,以正己烷（5.6）為空白,用分光光度計進行測定，入射光波長為450nm,測定

其吸光度值,平行測定3次,取均值。

溶液濃度按式(A.1)計算:

A3.01

X………………（A.1）

E0.01

式中:

X——β-胡蘿卜素標準儲備溶液的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL)；

A——β-胡蘿卜素標準儲備溶液的紫外吸光值；

E——β-胡蘿卜素在正己烷中的比吸光系數(shù)為0.2620；

3.01

——測定過程中稀釋倍數(shù)的換算系數(shù)。

0.01