第第頁蛋白質(zhì)多肽液相色譜純化方法簡介液相色譜解決方案蛋白質(zhì)、多肽液相色譜純化方法簡介！1、純化的一般目標和方法首先，自然來源或者重組表達的蛋白質(zhì)經(jīng)過一些粗提的步驟（例如：勻漿、離心、硫酸銨沉淀等）成為穩(wěn)定的可以用于色譜分別的樣品。然后進行捕獲色譜（capturechromatography），重要目標是濃縮和去除大量的簡單去除的雜質(zhì)，此步掛念的是流速和載量，常采納高載量、快流速凝膠。經(jīng)過濃縮的部分純化的樣品進行中級色譜（intermediatechromatography），目的是去除較難去除的雜質(zhì)，此步掛念的是辨別率，常采納高辨別率的細顆粒凝膠。后為了得到符合要求的終產(chǎn)品，去除殘存的雜質(zhì)以及目的蛋白的多聚物或者降解片斷，進行精制色譜（polishingchromatography），常采納具有高辨別率的凝膠過濾凝膠進行凝膠過濾色譜。2、純化前的準備工作（1）樣品穩(wěn)定性試驗a、測定樣品在pH2—9的穩(wěn)定性；b、測定樣品在0—4mol/LNaCl及0—2mol/L硫酸銨中的穩(wěn)定性；c、測定樣品在0—50%乙醇、甲醇中的穩(wěn)定性；d、測定樣品在4—40℃的穩(wěn)定性；e、室溫下靜置過夜，測定對蛋白水解酶的穩(wěn)定性。（2）樣品預(yù)處理a、去除樣品中顆粒物（0.45—0.22微米膜過濾或者10000g離心15分鐘）b、去除樣品中脂類（10000g離心15分鐘或有機溶劑抽提）c、去除樣品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）d、抑制樣品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制劑、低溫下快速第1步分別或在蛋白酶缺陷宿主中表達重組蛋白）（3）樣品的保存條件：短期儲存（小于24小時）a、避開接近或超過樣品的穩(wěn)定極限防止蛋白質(zhì)變性或沉淀b、在密閉容器中冰箱冷藏較長期儲存（數(shù)天）a、b、同上c、加入適當?shù)囊志鷦╅L期儲存a、同上b、冰凍或者hao凍干（真空冷凍干燥）保存。3、對每一純化步驟的評價相關(guān)方法的建立a、目的蛋白含量測定酶活性測定、生物活性測定、放射免疫、酶聯(lián)免疫、免疫電泳、熒光。b、總蛋白含量測定紫外汲取法、Lowry法、Bradford染料結(jié)合法（考馬斯亮蘭G—250）等。c、樣品多而雜度檢測HPLC（離子交換、凝膠過濾、反相）、SDS—PAGE、等電聚焦、毛細管電泳（CE）。4、蛋白質(zhì)的來源（1）天然蛋白：天然產(chǎn)物中的目的蛋白一般含量很少而且組分極多而雜，在分別過程中須采納多步驟才能去除各種雜質(zhì)，并應(yīng)在整個過程中降低蛋白水解酶的活性。（2）重組蛋白：重組蛋白則目標蛋白的豐度較高。重組蛋白重要有三種表達定位：a、細胞質(zhì)：在種情況下，必需破壞細胞結(jié)構(gòu)才能得到目的蛋白質(zhì)，同時伴隨著大量核酸和其它上千種宿主蛋白質(zhì)的釋放；在表達量較高的條件下，一般形成包涵體，包涵體含有過表達目的蛋白，且簡單通過高速離心分別，但是包涵體的溶解與復(fù)性是較多而雜的。b、外周質(zhì)：表達的蛋白質(zhì)存在于細菌內(nèi)膜與外膜之間，這樣目的蛋白可以較少地受到蛋白酶的作用并削減了宿主蛋白的污染。c、分泌到培育基：這種表達一般蛋白質(zhì)濃度較低，重要受到培育基中的污染。液相色譜填料流動相配制的特點液相色譜填料由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分構(gòu)成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工獲得正確牢靠的試驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。液相色譜填料的使用過程中，若碰到使用不當?shù)那闆r，會大大縮短色譜柱的使用壽命。為了延長色譜柱的使用壽命，應(yīng)對色譜柱進行適當?shù)谋Ｗo。液相色譜填料是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分別的目的，因此要求流動相具備以下的特點：a、流動相對樣品具有肯定的溶解本領(lǐng)，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。b、流動相具有肯定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特別情況除外）。c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分別效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用uv檢測器，可以使用對紫外汲取較低的溶劑配制。e、流