第二節(jié)發(fā)酵工程的無菌技術第一章發(fā)酵工程積極思維：肉湯腐敗與微生物有什么關系？19世紀中期以前，人們普遍相信生命現(xiàn)象是自然發(fā)生的。19世紀60年代，法國科學家巴斯德通過實驗證明了微生物不是自然發(fā)生的。煮沸肉湯，殺滅其中的細菌肉湯仍澄清，沒有細菌繁殖打斷瓶頸肉湯變混濁，細菌在肉湯中繁殖日常生活中，我們會用碘伏消毒液擦拭受傷破損的皮膚，從而殺滅傷口部位的部分微生物。那么，在發(fā)酵工程實踐中無菌操作是如何開展的呢？巴斯德在實驗一、發(fā)酵工程的滅菌方法和滅菌設備1、無菌技術：2、無菌技術應圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括消毒和滅菌。注：獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關鍵是防止雜菌污染；是指在操作過程中，保持物品與操作區(qū)域無菌的狀態(tài)并不被微生物污染的技術，其核心是滅菌；①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；②用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌；③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行；④實驗操作時應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸；（1）消毒①概念：②常用的消毒方法a、煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min，可以殺死微生物的營養(yǎng)細胞和一部分芽孢。b、巴氏消毒法：62～65℃下消毒30min或80～90℃處理30s～1min，適合一些不耐高溫的液體，如牛奶?？梢詺⑺琅Ｄ讨械慕^大多數(shù)微生物，并且不破壞牛奶的營養(yǎng)成分。指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。c、化學藥劑消毒法：用70%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。思考：利用酒精消毒時，酒精濃度是不是越高越好？析：高濃度酒精能將細菌表面的蛋白質凝固，并形成一層保護膜，阻止酒精進入細菌體內(nèi)，因而不能將細菌徹底殺死。酒精濃度低于70%，雖可進入細菌體內(nèi)，但不能將細菌徹底殺死。④紫外線消毒法：接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前可用紫外線照射30min。在照射前，適量噴灑石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強消毒效果。（2）滅菌附：芽孢和孢子的相關知識芽孢：有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。孢子：細菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的無性生殖細胞。能直接發(fā)育成新個體。①概念：指使用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。②常用滅菌的方法：a、干熱滅菌法耐高溫，需保持干燥的物品，適用于玻璃器皿(如試管、培養(yǎng)皿、移液管、注射器)、金屬器具(如針頭、鑷子、剪刀等)的滅菌；器具：電熱鼓風干燥箱（干熱滅菌箱）；條件：140~160℃下加熱2~3h；原理：使微生物細胞質膜破壞、蛋白質變性和原生質干燥等；對象：使滅菌器皿保持干燥；帶有膠皮或塑料的物品、液體及固體培養(yǎng)基一般不能采用電熱鼓風干燥箱干熱滅菌；優(yōu)點：缺點:電熱鼓風干燥箱：采用電熱鼓風干燥箱干熱滅菌時，一般以能否殺死細菌的芽孢作為徹底滅菌的標準。b、灼燒滅菌法接種工具如接種環(huán)、接種針，以及接種過程中的試管口或瓶口等易被污染部位；器具：酒精燈；條件：酒精燈外焰灼燒；效果：最徹底；原理：使微生物燃燒；對象：c、濕熱滅菌法：高壓蒸汽滅菌器具：高壓蒸汽滅菌鍋條件：100kPa、121℃下維持15-20min；原理：高溫蒸汽破壞蛋白質、核酸等結構使其變性；培養(yǎng)基、多種器材、物品等；優(yōu)點：操作簡便，效果可靠，可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體?；颈３峙囵B(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞；對象：高壓蒸汽滅菌鍋的使用：加水→裝鍋→加熱→排空冷空氣→保溫保壓→出鍋加水：

水量達到水位標記線即可；↓裝鍋：將待滅菌物品放在滅菌桶中，至少留1/3空間，蓋好鍋蓋，對稱旋緊鍋蓋四周的固定螺栓；↓加熱：出鍋：接通電源，打開開關，開始加熱；↓排空冷空氣：打開排氣閥，排出鍋內(nèi)殘留的冷空氣。當壓力表指針回降到“0”時，關閉氣閥，繼續(xù)加熱；高壓蒸汽滅菌鍋的使用：鍋內(nèi)壓力升至約103kPa、溫度達到121℃時控制熱源，保持壓力，維持15～20min

后，再關閉電源；當壓力表指針降至“0”點，待溫度下降后，打開排氣閥，旋開固定螺栓，開蓋，取出滅菌物品保溫保壓：↓↓滅菌完畢取出物品后，將鍋內(nèi)余水倒出，保持滅菌鍋內(nèi)壁及內(nèi)膽干燥，并蓋好鍋蓋。視頻：高壓蒸汽滅菌鍋使用思考：高壓蒸汽滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)的冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么要待壓力降到“0”時才能打開排氣閥？析：在同一溫度下，濕熱的滅菌能力比熱大，在使用高壓蒸汽滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排出是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果在壓力未降到“0”時打開排氣閥，會導致鍋內(nèi)壓力突然下降，使器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾培養(yǎng)基而發(fā)生污染。1、培養(yǎng)基滅菌為什么采用高壓蒸汽滅菌而不采用干熱滅菌？析：干熱滅菌箱內(nèi)的高溫會導致培養(yǎng)基的水分散失，而高壓蒸汽鍋內(nèi)的濕度較大，不會導致培養(yǎng)基的水分散失。2、如何制備一瓶無菌水？析：對一瓶有菌水進行高壓蒸汽滅菌處理。3、某同學在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設定要求，而鍋內(nèi)并沒有達到相應溫度，最可能的原因是什么？析：未將鍋內(nèi)冷空氣排盡。思考并回答：4、某同學從高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)拿出培養(yǎng)基后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基已經(jīng)濺滿了錐形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？析：高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表指針還未降至“0”點，就提前打開了高壓蒸汽滅菌鍋。在工業(yè)生產(chǎn)上制備無菌空氣，用于好氧微生物的發(fā)酵；在產(chǎn)品提取過程中，也可以利用過濾除菌法處理料液，以獲得無菌產(chǎn)品。d、過濾除菌法

概念：通過濾膜過濾阻留微生物從而達到除菌目的的方法；

器具：空氣除菌設備；

對象：空氣、料液，及在高溫下不穩(wěn)定的物質（大于濾膜孔徑的細菌等微生物顆粒阻留）

應用：空氣除菌設備：許多微生物產(chǎn)品是通過培養(yǎng)好氧微生物獲得的。通常在空氣中含有灰塵顆粒和各種雜菌，在陰雨天氣或環(huán)境污染比較嚴重的情況下，空氣中會懸浮大量的微生物。這些微生物一旦進入營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，會很快繁殖，影響發(fā)酵過程。讓含菌空氣通過無菌干燥的過濾介質，以阻截空氣中所含微生物?？諝獬O備不是滅菌，而是濾除了空氣中的各種雜菌。通過過濾除菌處理的空氣可達到幾乎無菌的程度，并有足夠的壓力和適宜的溫度，以滿足好氧微生物純培養(yǎng)的需要。二、發(fā)酵工程的無菌操作器具1、接種器具①接種：在無菌條件下將微生物接入培養(yǎng)基的操作過程；②常用接種器具包括玻璃涂布器、接種針、接種環(huán)等；③應用：玻璃涂布器常用于平板稀釋涂布接種，接種針用于穿刺接種，接種環(huán)用于斜面接種或在平板培養(yǎng)基上劃線接種；平板劃線接種2、轉移器具①移液管的應用：一般用于轉移部分液體培養(yǎng)物、系列稀釋微生物或分裝化學試劑；②刻度移液管：具有刻度的直形玻璃管，在需要控制試劑加入量時使用。視頻：移液管的潤洗及溶液的移?、畚⒘咳∫浩鳎寒斎∫毫亢苌贂r（如0.1mL），常采用微量取液器。微量取液器可分為固定容量的和可調(diào)容量的兩種；

視頻：微量移液器的使用3、超凈工作臺是利用工作臺內(nèi)紫外線燈的殺菌作用，并通過空氣過濾器過濾確保工作臺內(nèi)空氣的無菌、無污染。①概念：超凈工作臺是一種經(jīng)過空氣凈化而形成高潔凈操作環(huán)境的設備。②凈化原理：三、微生物接種和傳代的無菌技術1、微生物保存的生理狀態(tài)在人工創(chuàng)造的條件下，降低細胞的代謝水平，使細胞基本處于休眠狀態(tài)，即微生物的生長繁殖受到抑制但又不至于死亡。3、菌種保存的方法：①厭氧微生物接觸氧氣會受到抑制、損傷甚至死亡，常采用穿刺接種；

②斜面接種是常用的菌種傳代和低溫下保存菌種的方法。2、菌種保存的條件：低溫、干燥、真空；穿刺接種示意圖：斜面接種和培養(yǎng)酵母菌：準備接種接種環(huán)滅菌試管口滅菌挑取少量菌體劃線接種培養(yǎng)酵母菌①點燃酒精燈，取兩支盛有培養(yǎng)基的試管，其中一支內(nèi)有菌種，另一支為無菌的斜面培養(yǎng)基；（1）準備接種②用一只手的拇指和其他四指夾住試管，使管口齊平，管內(nèi)培養(yǎng)基斜面向上；將接種環(huán)的環(huán)端和接種時可能進入試管的部分放在酒精燈火焰上，來回灼燒多次，以達到迅速徹底滅菌的目的。（2）接種環(huán)滅菌在火焰附近用握有接種環(huán)的手的小拇指、無名指、中指和掌心拔去兩支試管上的試管塞，迅速將試管口通過火焰2~3次，以殺滅試管口上的微生物。（3）試管口滅菌“拔塞過火”將滅過菌的接種環(huán)伸入菌種管，先將環(huán)部接觸培養(yǎng)基斜面頂端或其他無菌體的培養(yǎng)基部位使其冷卻，再輕輕挑取少許菌體。（4）挑取菌體注：在抽出接種環(huán)時，注意其帶菌部位不要觸及管壁或通過火焰；迅速將上述帶菌的接種環(huán)伸入待接種的試管中，在培養(yǎng)基斜面上由底部向上輕輕劃“Z”型折線，將菌種接種到培養(yǎng)基上。（5）接種注：劃線時注意不要將培養(yǎng)基的表面劃破；（6）培養(yǎng)將試管口與試管塞分別通過火焰2~3次，迅速塞緊試管。多次灼燒接種環(huán)確保無菌，冷卻后，放回原處。將接種過菌種的試管放在恒溫箱中（溫度調(diào)至28℃）培養(yǎng)24h。視頻：斜面培養(yǎng)基微生物接種4、菌種保存的方法挑選典型菌落接種到斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)4℃左右的冰箱保藏2~3個月重新接種①短期保存：甘油管藏（一般可保存2~4年）-20℃以下的甘油管在冷凍箱中保藏；②長期保存：(1)培養(yǎng)微生物的試劑和器具都要進行高壓蒸汽滅菌

(

)(2)斜面培養(yǎng)基中含有大量營養(yǎng)物，可在常溫下長期保存菌株(

)(3)某研究小組從有機廢水中分離微生物用于廢水處理，培養(yǎng)過程中每隔一周觀察一次

(

)(4)為了防止污染，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后應趁熱快速挑取菌落(

)(5)穿刺接種可用于保藏厭氧菌種或研究微生物的運動(

)(6)菌體蛋白質的變性溫度與含水量相關，一般來說含水量越低，變性溫度越高(

)(7)一般以能否殺死細菌的芽孢作為徹底滅菌的標準(

)××××√習題鞏固：√√(8)使用高壓蒸汽滅菌鍋時，為充分利用空間，裝得越滿越好(

)(9)當高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表指針降至“0”點時，即可出鍋(

)(10)制備氨基酸、抗生素等的發(fā)酵過程，所需的微生物對空氣無菌的要求較低(

)(11)將移液管移入準備接受溶液的容器時，為避免污染，移液管不能接觸器壁(

)

(12)低溫、干燥、高氧是菌種保存的重要條件(

)(13)厭氧微生物常采用穿刺接種的方法將其保護在培養(yǎng)基中(

)(14)將含有新鮮菌種的試管放在－4℃的冰箱中保存有利于延長保存時間(

)×××××√×2.下列關于滅菌和消毒的說法，錯誤的是

A．滅菌是指殺死環(huán)境中的所有微生物，包括芽孢和孢子B．滅菌和消毒實質上是相同的C．接種環(huán)用灼燒法滅菌D．常用的滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌等3．下列關于高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法中，錯誤的是A．使用高壓蒸汽滅菌鍋時，需等鍋內(nèi)的冷空氣排盡后再關閉排氣閥B．培養(yǎng)基常用高壓蒸汽滅菌法處理C．滅菌結束后，需迅速將排氣閥打開，等壓力表降為“0”時再取出培養(yǎng)基D．滅菌前一般需要將錐形瓶的棉塞用牛皮紙或報紙包扎好BC4．下列操作能達到滅菌目的的是

A．用免洗酒精凝膠擦手B．制作泡菜前用開水燙洗容器C．在火焰上灼燒接種環(huán)D．防疫期間用石炭酸噴灑教室5．下列哪項不屬于無菌技術？A．將培養(yǎng)皿、接種工具和培養(yǎng)基進行滅菌B．實驗操作應在酒精燈火焰附近進行C．避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸D．操作者的衣著和手用純凈水洗干凈CD6．培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌或消毒方法依次是

①化學消毒②灼燒滅菌③干熱滅菌④紫外線消毒⑤高壓蒸汽滅菌⑥巴氏消毒法 A.⑤③②①④⑥ B.①②③④⑤⑥ C.⑥②③④①⑤ D.③④②①⑥⑤A7.高壓蒸汽滅菌的操作順序應該是①加水②排冷氣③裝置滅菌物品④約103kPa下滅菌⑤加蓋

⑥0kPa下排氣，打開滅菌鍋A.①③⑤②④⑥ B.②③⑤①⑥④C.①②④⑤③⑥ D.②⑤①⑥④③A8.下列關于斜面接種和培養(yǎng)酵母菌的敘述，錯誤的是A.接種環(huán)滅菌時，只需將其環(huán)端進行滅菌B.接種時，應在培養(yǎng)基斜面上由底部向上輕輕劃“Z”型折線C.挑取菌體時應先將接種環(huán)的環(huán)部接觸培養(yǎng)基斜面頂端或其他無菌體的

培養(yǎng)基部位使其冷卻D.將菌種置于4℃左右的冰箱中保藏即有利于減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，

又有利于延長保存時間A9.下列關于微生物接種和傳代的無菌技術的敘述，錯誤的是

A.菌種的傳代和保存要考慮菌種的生理、生化特性B.低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物生長和代謝

的作用C.破傷風芽孢桿菌可在培養(yǎng)基深處的厭氧環(huán)境下生長D.在培養(yǎng)基斜面上接種時應由上部向底部輕輕劃“Z”型折線D10．為了保持菌種的純凈需要進行菌種的保存，下列有關敘述錯誤的是A．對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保存的方法B．甘油管藏法保存菌種時使用的甘油需滅菌C．臨時保藏菌種容易被污染或產(chǎn)生變異D．對于需要長期保存的菌種，可以采用低溫－4℃保藏的方法D11．將酵母菌菌種從菌種試管接種到另一支試管的操作，下列說法有誤的一項是A．整個接種過程都要在酒精燈的火焰附近進行B．接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒之后即可伸入菌種試管挑取少許菌種C．菌種試管口和待接種的試管口接種前后都要通過酒精燈火焰2～3次D．帶菌的接種環(huán)應在培養(yǎng)基斜面上由底部向上輕輕劃“Z”型折線B12．下列關于無菌操作的敘述，正確的是

A．接種時超凈臺內(nèi)同時打開紫外燈和過濾風B．斜面接種時，含菌種的試管口和不含菌種的試管口都要通過酒精燈火焰滅菌C．用脫脂棉制成的棉塞塞住試管口，用牛皮紙包扎，放入滅菌鍋內(nèi)滅菌D．接種環(huán)滅菌后迅速挑取少量菌種進行接種B13．下列有關消毒和滅菌的說法，錯誤的是

A．水廠供應的自來水通常是經(jīng)過氯氣消毒B．使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設定要求，而鍋內(nèi)并沒有達到相應溫度，最可能的原因是未將鍋內(nèi)冷空氣排盡C．玻璃和金屬材質的實驗器具不可以放入干熱滅菌箱中進行干熱滅菌D．牛奶的消毒常采用巴氏消毒法，不僅可以達到消毒目的，同時營養(yǎng)物質損失較少C三、平板劃線法分離和純化微生物1、平板劃線法定義:

把含有多種微生物的雜菌樣品，通過在特定的瓊脂平板表面劃線稀釋，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，從而獲得單個菌落的方法。將微生物樣品在瓊脂平板表面多次做“由點到線”的稀釋劃線，經(jīng)過這樣的操作可得到較多獨立分布的單個微生物。經(jīng)過平板培養(yǎng)后，會形成部分由單個微生物生長、繁殖而成的純種菌落。2、平板劃線法的做法:

由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。3、微生物的純培養(yǎng)：酵母菌①酵母菌是兼性厭氧型單細胞真菌，可以進行出芽生殖，也可以進孢子生殖；②培養(yǎng)的最適pH為4.5～5.0，最適生長溫度為28～30℃；4、平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落（視頻）③可以用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可以用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，但要獲得純化的酵母菌菌落，則需要通過固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。4、通過平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落嘗試通過平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落。（1）實驗目的（2）實驗原理平板劃線法是實驗室中進行微生物分離和純化的常用方法之一。在制作好的酵母菌培養(yǎng)基平板上，采用無菌操作技術及平板劃線法能夠獲得純化的酵母菌菌落。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基能滿足酵母菌生長、繁殖的營養(yǎng)需要，利用前面實驗中配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基制作平板。酵母菌樣本（菌種）；接種環(huán)、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。（3）實驗器材和試劑（4）實驗步驟②培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿滅菌用牛皮紙包扎已配制的培養(yǎng)基已包好的培養(yǎng)皿高壓蒸汽滅菌鍋滅菌①配制馬鈴薯葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基并調(diào)pH＋→將滅好菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿取出，置于操作臺上，待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時（可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可），在酒精燈火焰附近倒平板。③倒平板倒平板操作步驟：拔出錐形瓶的棉塞將瓶口迅速通過火焰：轉動瓶口，確保瓶口被滅菌；倒培養(yǎng)基：在火焰旁用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基（10~20mL）倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋；等培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒過來放置注：①平板冷凝后倒置的原因：將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染；②如何確定所倒平板是否被雜菌污染：將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底；判斷：倒平板時應該將皿蓋打開放到一邊，然后再倒培養(yǎng)基（）×④平板劃線和培養(yǎng)（人教版）將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅在火焰旁冷卻接種環(huán)，并拔出裝有酵母菌的棉塞將試管口通過火焰將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，蘸取一環(huán)菌液將試管通過火焰，并塞上棉塞左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連將平板倒置放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。提醒：為什么要同時放入未接種的平板？作對照，該培養(yǎng)皿無菌落說明培養(yǎng)基沒有污染完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右(培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。分區(qū)劃線法：12345平板劃線法注意事項:第1區(qū)劃線接種環(huán)滅菌第2區(qū)劃線接種環(huán)滅菌第3區(qū)劃線接種環(huán)滅菌接種環(huán)滅菌①接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次；②劃線首尾不能相接；③每次劃線前接種環(huán)進行滅菌；④劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)；注：每次劃線前后灼燒接種環(huán)的目的是什么？灼燒時間目的第一次劃線前每次劃線前劃線結束后殺死接種環(huán)上可能存在的微生物，防止外來微生物干擾殺死上一次劃線結束后接種環(huán)殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端殺死接種環(huán)上殘存的菌種，避免菌種污染環(huán)境和感染操作者④平板劃線和培養(yǎng)（蘇教版）在一個倒有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿的皿底外側面中央用記號筆畫一直線，再在此線中間處畫一垂直線，將培養(yǎng)皿分成三個區(qū)域：第1區(qū)域、第2區(qū)域、第3區(qū)域，分別標上“1”“2”“3”字樣。123接種劃線時，將帶有酵母菌樣品的接種環(huán)，在培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基的第1區(qū)域劃線，然后再從第1區(qū)域劃到第2區(qū)域，從第2區(qū)域劃到第3區(qū)域（在第2次、第3次劃線前，接種環(huán)需過火滅菌）。在固體培養(yǎng)基表面完成多次“由點到線”的逐步稀釋。劃完線后蓋上皿蓋，倒置培養(yǎng)。接種和劃線操作需要在酒精燈火焰附近進行。通過培養(yǎng)可以得到由單個酵母菌增殖而形成的菌落。四、稀釋涂布平板法分離和純化微生物1、稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，使其中的微生物充分分散，培養(yǎng)后在平板培養(yǎng)基表面形成多個單菌落。2、稀釋涂布平板法應用：既可用于菌種的分離和純化，也可以用于微生物的計數(shù)。101102103104105106（1）將分別盛有9mL無菌水的試管滅菌并編號；（2）用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻；（3）從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入102倍稀釋的試管中，重復步驟2，直到第六支試管；3、稀釋涂布平板法的操作過程——系列稀釋操作4、稀釋涂布平板法的操作過程——涂布平板操作將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉動培養(yǎng)皿，使涂布均勻待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，培養(yǎng)選擇30-300個菌落的平板進行計數(shù)；每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；5、稀釋涂布平板法計數(shù)原則:稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照稀釋106倍注：平板劃線法不能對菌種進行計數(shù)；而稀釋涂布平板法可以計數(shù)，但計數(shù)值會比實際值偏小，因為一個菌落有可能是由兩個或者多個的菌體一起形成的；①利用選擇培養(yǎng)基可以篩選和分離某種微生物。②在高度稀釋的條件下，于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)該微生物，形成單個菌落。單個菌落即為純化培養(yǎng)物，通過對菌落數(shù)量的統(tǒng)計，可以計算出樣品中的含菌數(shù)。6、實驗：分離土壤中分解尿素的細菌并進行計數(shù)（視頻）（1）實驗目的（2）實驗原理①學會配制選擇培養(yǎng)基，以分離出能分解尿素的細菌。②學會采用稀釋涂布平板法分離和培養(yǎng)分解尿素的細菌，并進行計數(shù)。（3）實驗器材和試劑①土壤樣品。②滅菌處理過的各種工具。③配制以尿素為氮源的1000mL選擇培養(yǎng)基的試劑以及調(diào)節(jié)pH的相關試劑。（4）實驗步驟鏟取土壤，將樣品裝入紙袋中注：取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌；1×1090mL無菌水10g將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋1mL1×1029mL無菌水①制備土壤懸液1×1021mL1mL1mL1mL1mL1×1031×1041×1051×1061×107每個試管中均有9mL無菌水②配置培養(yǎng)基及制作平板設置一組不加氮源的平板，作為空白對照。在大燒杯加入培養(yǎng)基的成分，并加瓊脂煮沸溶解，定容，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4，裝入錐形瓶，滅菌，冷卻至50℃，倒平板。③涂布從濃度最低的土壤懸液開始，每個濃度設置3個重復。④培養(yǎng)與觀察

另設一組對照，用等體積無菌水代替土壤懸液，用來判斷平板在實驗前或實驗過程中是否被污染。倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1~2d，每24h觀察一次；計算時，選取菌落數(shù)為30~300的一組為樣本進行統(tǒng)計。公式:每克土壤樣品的細菌數(shù)=某一稀釋度幾次重復培養(yǎng)后的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)÷涂布所用稀釋液體積數(shù)⑤計數(shù)菌落稀釋105倍稀釋106倍稀釋107倍空白對照例：甲同學做此實驗在稀釋倍數(shù)105獲得3個平板，菌落數(shù)分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數(shù)目？每克土壤中細菌數(shù)目＝（90×105

）÷0.1=9×107個解：每個平板中平均菌落數(shù)＝（80+90+100）÷3＝90個(1)倒平板后，待平板冷凝之后需將其倒置(

)(2)若皿蓋和皿底之間濺上培養(yǎng)基，這個培養(yǎng)基不可再用(

)(3)平板劃線法接種時，每一次劃線前都要挑取菌體(

)(4)培養(yǎng)微生物的溫度因菌種不同而稍有差異(

)(5)倒平板后需間歇晃動，以保證表面平整()(6)如果不能確定某菌落是否由單個細胞繁殖而來，可通過反復多次進行平板劃線進行培養(yǎng)分離純化(

)(7)在平板3個區(qū)域劃線時，要按照順序不間斷進行劃線快速完成

(

)(8)經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基冷卻到50℃左右進行倒平板并將平板倒置備用(

)√√×√×××√習題鞏固：(9)稀釋涂布平板法可用于菌種的分離和純化，還可以用于微生物計數(shù)(

)(10)測定不同微生物數(shù)量時，接種的土壤懸液的稀釋度相同(

)(11)采用稀釋涂布平板法培養(yǎng)和計算得到的微生物的數(shù)量一般比稀釋液中實際微生物的數(shù)量要少(

)(12)分離土壤中分解尿素的細菌配制培養(yǎng)基時要用尿素作為唯一碳源

(

)√×√×2．平板劃線法是微生物培養(yǎng)中常用的接種方法。下列敘述錯誤的

A．在酒精燈的火焰旁操作可以避免周圍環(huán)境中微生物的污染B．第二次及以后劃線均要從上次劃線末端開始以達到分離單菌落的目的C．劃線用力大小要適當防止劃破培養(yǎng)基，最后一區(qū)域要與第一區(qū)域相連D．接種后需將平板倒置培養(yǎng)，防止冷凝水落入培養(yǎng)基造成污染C3．下列關于平板劃線法原理的敘述，錯誤的是

A．劃線過程中，接種環(huán)上的菌液逐漸減少B．劃線最后部分的細菌間的距離加大C．在適宜條件下，由多個細胞分裂繁殖產(chǎn)生的新細胞聚集成為單菌落D．將單菌落接種到試管斜面上，培養(yǎng)后形成的菌群就是由一個細菌產(chǎn)生的后代C4.下圖為實驗室培養(yǎng)和純化大腸桿菌過程中的部分操作步驟，下列說法錯誤的是

A．①②③步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行B．步驟①中待倒入的培養(yǎng)基冷卻后蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋C．步驟③中，每次劃線前后都需對接種環(huán)進行滅菌處理D．劃線接種結束后，將圖④平板倒置后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)B5．在分離、純化大腸桿菌實驗中