基因工程

GeneticEngineering

主講教師：李黃金Email:lihuangji任課教師：張文峰、陳偉生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院２０13第一章基因工程概論

自我介紹98年獲理學(xué)博士學(xué)位，中山大學(xué)92-2006年在企業(yè)工作“重組人表皮生長(zhǎng)因子(rhEGF)衍生物”*國(guó)家一類(lèi)新藥(1998)*國(guó)家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程(2002)*《中國(guó)藥典》2005版三部收錄品種第一章基因工程概論第一章基因工程概述

基因工程與生物技術(shù)世紀(jì)基因工程的基本概念、原理與過(guò)程基因工程的歷史基因工程的未來(lái)課程結(jié)構(gòu)

第一章基因工程概論一、基因工程與生物技術(shù)世紀(jì)第一章基因工程概論人類(lèi)文明發(fā)展的三次技術(shù)革命工業(yè)革命——19世紀(jì)，解放雙手信息革命——20世紀(jì)，解放大腦生物技術(shù)革命——21世紀(jì)，改造生命，創(chuàng)造生命第一章基因工程概論生物技術(shù)世紀(jì)

“我們正處在世界歷史的一場(chǎng)偉大變革中，一場(chǎng)從物理學(xué)和化學(xué)時(shí)代轉(zhuǎn)變到生物學(xué)時(shí)代、從工業(yè)革命轉(zhuǎn)變到生物技術(shù)世紀(jì)的偉大革命”杰里金.里夫金美國(guó)華盛頓特區(qū)，經(jīng)濟(jì)趨勢(shì)基金會(huì)總裁第一章基因工程概論生物技術(shù)？生物技術(shù)（Biotechnology）根據(jù)現(xiàn)代生命科學(xué)理論與各種工程技術(shù)所建立的、用以改造各種生物有機(jī)體來(lái)滿(mǎn)足人類(lèi)各種需要的技術(shù)體系。以細(xì)胞與基因操作為核心。第一章基因工程概論現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵領(lǐng)域醫(yī)藥生物技術(shù)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工業(yè)生物技術(shù)能源生物技術(shù)環(huán)境生物技術(shù)信息生物技術(shù)國(guó)防生物技術(shù)第一章基因工程概論基因工程——生物技術(shù)體系的核心轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物重組微生物天然細(xì)胞蛋白質(zhì)、酶高分子化合物小分子化合物工程細(xì)胞功能基因基因工程藥物、診斷試劑基因治療/疫苗干細(xì)胞治療人類(lèi)自身功能基因動(dòng)、植物、微生物工業(yè)領(lǐng)域醫(yī)藥領(lǐng)域農(nóng)業(yè)領(lǐng)域能源領(lǐng)域環(huán)境領(lǐng)域軍事領(lǐng)域第一章基因工程概論基因工程是現(xiàn)代生物技術(shù)體系的核心

細(xì)胞工程發(fā)酵工程分離工程蛋白質(zhì)工程抗體工程酶工程途徑工程。。。。?；蚬こ痰谝徽禄蚬こ谈耪摶蚬こ蹋℅eneticEngineering）是指按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，將不同來(lái)源的目的基因在體外與載體DNA進(jìn)行拼接重組，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使之持續(xù)穩(wěn)定繁殖，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品，或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。二、基因工程的概念、原理與過(guò)程1、概念第一章基因工程概論廣義的基因工程基因工程是指DNA重組技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是目的基因克隆、表達(dá)載體和工程菌（或細(xì)胞）的構(gòu)建與分析。下游技術(shù)基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化過(guò)程。第一章基因工程概論基因工程的應(yīng)用分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計(jì)、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種第一章基因工程概論基因工程概念的發(fā)展遺傳工程（GeneticEngineering)DNA重組技術(shù)（DNARecombination）分子/基因克?。∕olecular/GeneCloning）基因工程（Gene/GeneticEngineering)基因操作（GeneManipulation)應(yīng)用領(lǐng)域以“基因工程”、“DNA重組”為主第一章基因工程概論有關(guān)術(shù)語(yǔ)克隆（clone)：無(wú)性繁殖系克隆化（cloning）：構(gòu)建無(wú)性繁殖系的操作過(guò)程。重組子（recombnants)：不同來(lái)源DNA插入載體分子所形成的雜合分子。重組（recombination）：構(gòu)建DNA重組子的過(guò)程構(gòu)建（construct):通過(guò)基因操作獲得重組DNA、重組細(xì)胞或動(dòng)植物個(gè)體的過(guò)程。第一章基因工程概論工程菌（細(xì)胞）：

通過(guò)基因操作所獲得的、用于生產(chǎn)特定產(chǎn)物的微生物菌種（工程菌）或動(dòng)植物細(xì)胞（工程細(xì)胞）。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（植物）通過(guò)基因操作所獲得的、帶有特定新功能基因的動(dòng)物或植物。分子育種基于基因操作技術(shù)改良動(dòng)植物生產(chǎn)性能、并獲得新品種的過(guò)程?；蚬こ坍a(chǎn)業(yè)化中的幾個(gè)概念第一章基因工程概論基因工程的三大要素基因：供體，目的基因（Vs用途,interesting/targetgene）、外源基因（Vs宿主,foreigngene）載體：能將外源基因帶入受體細(xì)胞，并能穩(wěn)定遺

傳的DNA分子。宿主：受體，能攝取外源DNA、并能使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞（組織、器官或個(gè)體）。第一章基因工程概論

●基因工程最突出的二個(gè)優(yōu)點(diǎn)

打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間界限

可使原核生物與真核生物之間、動(dòng)物與植物之間、甚至人與其他生物之間的遺傳信息進(jìn)行重組和轉(zhuǎn)移?？稍谑荏w細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并保存目的基因

為大量制備純化的目的基因、研究基因的結(jié)構(gòu)與功能提供了基礎(chǔ)。第一章基因工程概論2、基因工程的基本原理★基因的物質(zhì)基礎(chǔ)一致

所有物種可通過(guò)DNA重組來(lái)進(jìn)行遺傳改造?！锼形锓NDNA的復(fù)制機(jī)制相同宿主來(lái)源的復(fù)制調(diào)控元件可使目的基因在異源宿主中高效擴(kuò)增與穩(wěn)定傳代?！锼形锓N遵循相同的基因表達(dá)原理宿主來(lái)源的轉(zhuǎn)錄水平（啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子）和翻譯水平（核糖體結(jié)合位點(diǎn)、偏愛(ài)密碼子）的調(diào)控元件可實(shí)現(xiàn)目的基因的異源高效表達(dá)。第一章基因工程概論3、基因工程的基本過(guò)程★目的基因克隆切、接、轉(zhuǎn)、增、檢★獲得目的基因PCR、RT-PCR、化學(xué)合成、基因文庫(kù)★工程細(xì)胞或個(gè)體構(gòu)建將含目的基因表達(dá)元件的載體導(dǎo)入特定宿主細(xì)胞或個(gè)體，并篩選可穩(wěn)定遺傳與表達(dá)目的基因的重組子第一章基因工程概論基因克隆的基本過(guò)程切、接、轉(zhuǎn)、增、檢mRNA合成大腸桿菌是中心角色第一章基因工程概論體外重組（切、接）第一章基因工程概論切：用DNA限制性?xún)?nèi)切酶切割目的基因與載體DNA

接：用DNA連接酶連接目的基因與載體DNA，獲得含

目的基因、復(fù)制元件與篩選標(biāo)記的重組DNA分子。轉(zhuǎn)：將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞（大腸桿菌）。

增：少量進(jìn)入宿主細(xì)胞的重組DNA分子利用復(fù)制元件自

主復(fù)制、并大量擴(kuò)增。檢：利用篩選標(biāo)記基因和/或目的基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行重

組子的篩選與鑒定?；蚬こ痰幕具^(guò)程第一章基因工程概論基因工程（廣義）基本過(guò)程轉(zhuǎn)化克隆宿主，制備表達(dá)載體。

轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主第一章基因工程概論基因工程發(fā)酵（培養(yǎng)）第一章基因工程概論中試規(guī)模分離純化—AKTAexplorer100第一章基因工程概論19461950195519601965197019751980198519901995

1944DNA是遺傳物質(zhì)1949Hbs貧血1953雙螺旋1956HbsGlu-Val1966遺傳密碼第一個(gè)R酶1972重組質(zhì)粒1975DNA雜交1977DNA測(cè)序1981轉(zhuǎn)G小鼠1983HD病G定位1985PCR1986位置克隆1987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一個(gè)基因治療1995細(xì)菌G組序列1996酵母基因組序列三、基因工程的歷史第一章基因工程概論

（一）基因工程誕生的理論基礎(chǔ)

20世紀(jì)中期分子遺傳學(xué)理論的重大進(jìn)展

1．確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA

肺炎鏈球菌光滑型和粗糙型的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)噬菌體DNA轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

第一章基因工程概論●

1944年，美國(guó)微生物學(xué)家Avery證明基因就是DNA分子，提出DNA是遺傳信息的載體。第一章基因工程概論2、Watson、Crick闡明DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（1953）第一章基因工程概論

3．生物遺傳的“中心法則”解決了遺傳信息的流向和遺傳性狀的相互關(guān)系，揭示了生命遺傳信息傳遞基本規(guī)律。

自我復(fù)制，遺傳信息由父代傳給子代；通過(guò)轉(zhuǎn)錄，遺傳信息傳給RNA；通過(guò)翻譯，信息傳給蛋白質(zhì)和酶；基因型決定生物的表型。DNA

RNA

protein第一章基因工程概論

4．“操縱子”學(xué)說(shuō)揭示了基因表達(dá)和調(diào)控的機(jī)制。

第一章基因工程概論5、破譯了全部的遺傳密碼第一章基因工程概論基因工程的理論依據(jù)

相同的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)（DNA）相同的遺傳機(jī)制（DNA的復(fù)制）相同的基因表達(dá)法則（中心法則）通用的遺傳密碼（64個(gè)密碼子）多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系基因可重組或轉(zhuǎn)移（天然重組、轉(zhuǎn)座）第一章基因工程概論

1．核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

——為DNA的體外重組準(zhǔn)備了基本的“工具”Smith發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶(restrictienendonuclease，RE)HindII。分子手術(shù)刀:特異性切割Boyer發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)用于基因工程的內(nèi)切酶EcoRIKhorana發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶（Ligase），粘合劑:能將DNA片段連接在一起（二）基因工程誕生的技術(shù)基礎(chǔ)第一章基因工程概論Boyer發(fā)現(xiàn)的EcoRI第一章基因工程概論

2．DNA載體系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

目的基因、DNA片段不能復(fù)制，也易破壞。必須連到具有復(fù)制能力的載體（vector)DNA分子上。研究表明質(zhì)粒、噬菌體和病毒是理想的載體分子。大腸桿菌的質(zhì)粒首先用于載體。第一章基因工程概論3、大腸桿菌DNA轉(zhuǎn)化體系建立

1970年發(fā)現(xiàn)氯化鈣處理過(guò)的細(xì)胞易于吸收接納外源DNA；

1972年CohenC報(bào)道，質(zhì)粒DNA也能被大腸桿菌吸收。而后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)改造的質(zhì)粒、噬菌體和病毒都可以攜帶目的DNA片段和基因，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，建立該基因的無(wú)性繁殖系。第一章基因工程概論

4、DNA分離、純化技術(shù)的建立

凝膠電泳：Agarosegel,PAGE

可以分離純化DNA片段，并檢測(cè)連接情況

第一章基因工程概論（三）基因工程的誕生1980年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)1972年斯坦福大學(xué)的PaulBerg小組完成了首次體外重組實(shí)驗(yàn)：

Berg的開(kāi)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)將SV40的DNA片段與

噬菌體的DNA片段連接起來(lái)。第一章基因工程概論DNA重組(體外）：不同的DNA分子間發(fā)生共價(jià)連接形成重組DNA分子。重組DNASV40DNADNA片段（用DNA末端轉(zhuǎn)移酶，而非限制性?xún)?nèi)切酶）T4DNA連接酶第一章基因工程概論Boyer和Cohen進(jìn)行了第一個(gè)基因工程實(shí)驗(yàn)第一章基因工程概論

2、1973年Cohen成功地進(jìn)行了體外重組和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

分別把編碼卡那霉素和四環(huán)素抗性基因的兩種質(zhì)粒酶切、連接，再將這種重組的DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，某些轉(zhuǎn)化菌落具有既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的雙重抗體特性。他的工作是世界上第一次成功的基因重組實(shí)驗(yàn)，并有基因表達(dá)及新的表型。第一章基因工程概論1973-Boyer,Cohen&Chang:

真正意義上的基因工程實(shí)驗(yàn)

TransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies第一章基因工程概論pSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基因DNA連接酶重組DNA分子第一章基因工程概論培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌第一章基因工程概論

后來(lái)又把非洲爪蟾核糖體基因片段同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)。Boyer-Cohen實(shí)驗(yàn)第一章基因工程概論1982年第一章基因工程概論2000年，法國(guó)科學(xué)家利用基因技術(shù)“制造”出了一只可以發(fā)出綠色熒光的兔子“Alba”。應(yīng)用了受精卵顯微注射技術(shù)，從水母身上采集了熒光蛋白，基因改良后，使它的發(fā)光率比原先提高了兩倍，再將該基因植入到了兔子的受精卵中，由此培養(yǎng)出了會(huì)發(fā)光的兔子Alba。在普遍光線下，它看上去與其它同類(lèi)沒(méi)有區(qū)別，但是在較暗的光線下，它的身體就會(huì)放射出奇異的綠光來(lái)。

第一章基因工程概論基因工程的歷史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重組技術(shù)1976：世界上第一個(gè)基因公司“Genetech”在美國(guó)成立1978：Genetech公司在大腸桿菌中表達(dá)出胰島素1982：世界上第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素上市1988：PCR技術(shù)誕生1989：我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物rhIFNα1b上市2003:世界上第一個(gè)基因治療藥物重組腺病毒-p53上市第一章基因工程概論四、基因工程的未來(lái)第一章基因工程概論第一章基因工程概論只有想不到的沒(méi)有辦不到的第一章基因工程概論第一章基因工程概論第一章基因工程概論基因治療第一章基因工程概論基因工程藥物第一章基因工程概論第一章基因工程概論疫苗（抗原）的基因工程第二代疫苗：基因工程疫苗第一代疫苗：滅活疫苗（牛痘疫苗）利用酵母菌生產(chǎn)的重組乙肝疫苗第一章基因工程概論FDA正式批準(zhǔn)全球首支宮頸癌疫苗第一章基因工程概論生物反應(yīng)器：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

—安全廉價(jià)環(huán)