ICSCCSB41GB/T42115—2022Diagnostictechniquesforbovinemalignantcatarrhalfever國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T42115—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國動物衛(wèi)生標準化技術(shù)委員會(SAC/TC181)歸口。本文件起草單位：中國動物疫病預(yù)防控制中心、青海省動物疫病預(yù)防控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心、江西省動物疫病預(yù)防控制中心、西藏自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團動物疫病預(yù)防控制中心、黑龍江省動物疫病預(yù)防與控制中心。ⅡGB/T42115—2022牛惡性卡他熱(BovineMalignantCatarrhalFever,BMCF)是由皰疹病毒科丙型皰疹病毒亞科的惡動物疫病。在與反芻動物相關(guān)的至少10余種皰疹病毒中，能引發(fā)惡性卡他熱且具有致病性的病原分別是綿羊皰疹病毒2型(OvineHerpesvirus2,OvHV-2)和猖羚皰疹病毒1型(AlcelaphineHerpesvirus1,AlHV-1),事實上幾乎所有的牛惡性卡他熱臨床病例，都是由綿羊和牛羚所攜帶的病毒感染造成的。準方法一致。其中病原分離方法適用于從活體動物腫脹的體表淋巴結(jié)、外周血液中以及從死亡動物的脾臟、腎臟或肝臟中分離MCFV;聚合酶鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)適用于檢測MCFV核酸，可用于對前病毒DNA的檢測；間接免疫熒光抗體試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)適用于檢測血清樣品中的MCFV抗體，可用于實驗室診斷、流1GB/T42115—2022牛惡性卡他熱診斷技術(shù)2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4臨床診斷4.1.1牛惡性卡他熱常發(fā)生于水牛、奶牛、黃牛等牛屬反芻動物。在所有易感動物中黃牛和水牛易感性強，尤以1歲～4歲的青壯年牛易發(fā)病，老年牛發(fā)病較少。少數(shù)牛發(fā)病后呈溫和型或隱性感染的情4.1.2牛羚、角馬、羚羊等野生動物以及吸血昆蟲是本病的主要傳染源；在沒有牛羚等野生動物的地區(qū)，隱性感染的綿羊是本病的主要感染來源，發(fā)病牛常有與綿羊接觸的歷史，如同群放牧或者同欄飼養(yǎng)等。頭眼型為最常見的病型，死亡率較高。病初體溫升高至40℃以上，食欲和反芻減少，頭部皮膚發(fā)熱。常在發(fā)病的第2天出現(xiàn)眼、口、鼻黏膜癥狀，雙眼結(jié)膜劇烈發(fā)炎，流出黃褐色膿性及纖維素性分泌2GB/T42115—20225病理診斷性淋巴增殖和壞死，出現(xiàn)廣泛性血管炎。腎臟和肝臟等部位的血管出現(xiàn)淋巴細胞或者單核細胞浸潤。及相應(yīng)炎癥病理變化。6病原學(xué)方法除特殊說明外，本文件所有操作程序均應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。3GB/T42115—20226.2.1.2細胞生長液：按附錄A中的A.1描述的方法配制。6.2.1.4Hank's平衡鹽溶液。6.2.1.7pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS):按A.5描述的方法配制。6.2.1.11無菌濾芯吸咀。6.2.1.12抗凝真空采血管。6.2.1.13聚四氟乙烯袋。6.2.2.2普通冰箱(2℃~8℃)。6.2.2.4倒置生物顯微鏡。6.2.2.5二級生物安全柜。6.2.2.6超凈工作臺。6.2.2.7通用離心機。無菌采集表現(xiàn)出4.2描述的臨床癥狀，剖檢出現(xiàn)第5章描述的病理變化的病牛的抗凝外周血或新外周血液樣品按照商品化的白細胞提取試劑盒說明書提取白細胞細胞培養(yǎng)液，37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。在加入新維持液前先以pH7.2磷酸鹽緩沖液洗一次，除去紅細胞及沒有貼壁的細胞，每3d換液一次，連續(xù)培養(yǎng)約7d～21d并觀察細胞病變。初代培養(yǎng)以形成多核巨細胞為主(多在接種后3d～14d內(nèi)出現(xiàn))。組織學(xué)檢查，可見到嗜酸性核內(nèi)包涵體4GB/T42115—2022將淋巴結(jié)或脾臟剪成1mm～2mm的碎塊，充分磨碎后以維持液制成約10%的組織懸液，再經(jīng)維連續(xù)培養(yǎng)約7d～21d并觀察細胞病變。初代培養(yǎng)可以形成多核巨細胞為主(多在接種后3d~14d內(nèi)出現(xiàn))。組織學(xué)檢查，可見到嗜酸性核內(nèi)包涵體。隨傳代次數(shù)的增加，細胞病變的出現(xiàn)惡性卡他熱病毒感染細胞典型細胞病變?yōu)榧毎诤闲纬珊习w，即多數(shù)細胞發(fā)生相互融合而成巨細胞。一般在接種后3d～14d內(nèi)，初代培養(yǎng)的細胞即可形成多核巨細胞。每個合胞體細胞中含有2個～20個細胞核，并且可見到嗜酸性核內(nèi)包涵體。隨傳代次數(shù)的增加，細胞病變的出現(xiàn)速度及程胞培養(yǎng)飛片，并采用間接免疫熒光抗體技術(shù)(按照附錄D給出的方法進行操作)。血液樣品或剖檢組織樣品接種后，出現(xiàn)6.2.4.3中描述的細胞病變，并且經(jīng)間接免疫熒光抗體染6.3聚合酶鏈式反應(yīng)(半巢式)6.3.1.1DNA提取試劑盒。6.3.1.2商品化單核細胞分離試劑。6.3.1.32×Taq緩沖液。6.3.1.410×PCR反應(yīng)液。6.3.1.6DL-2000DNAMarker。6.3.1.71%瓊脂糖凝膠(按附錄E給出的方法進行配制)。6.3.1.85×TBE電泳緩沖液(按附錄E給出的方法進行配制)。6.3.1.9無菌濾芯吸咀。56.3.6.1DNA提取置于—20℃冰箱備用。6.3.6.2半巢式PCR反應(yīng)——1μL的上游引物POL1(10μmol/L);——1μL的下游引物POL2(10μmol/L);——5pL的模板DNA;6.3.6.2.2第二輪PCR擴增(檢測OvHV-2型惡性卡他熱病毒核酸序列)6GB/T42115—2022-—1μL的上游引物OMVPol2(10μmol/L);——1μL的下游引物POL2(10μmol/L);——2pL的模板DNA(第一輪PCR擴增產(chǎn)物);——1μL的上游引物AlHVPol2(10μmol/L);——1μL的下游引物POL2(10μmol/L);——2μL的模板DNA(第一輪PCR擴增產(chǎn)物);——8.5pL的滅菌雙蒸水。延伸10min。將PCR擴增產(chǎn)物和DNA分子量標準于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，100V～120V恒壓電泳出現(xiàn)特異性條帶，則判該樣品中含有綿羊皰疹病毒2型(OvHV-2型)惡性卡他熱病毒核酸；如果使用皰疹病毒1型(AlHV-1型)惡性卡他熱病毒核酸。為了進一步驗證檢測結(jié)果，可將PCR產(chǎn)物回收純化后進行測序。如果測序結(jié)果與附錄F中或與GenBank中綿羊皰疹病毒2型(OvHV-2型)惡性卡他熱病毒基因序列一致，則判該樣品中含有OvHV-2型惡性卡他熱病毒；如果測序結(jié)果與附錄F中或與GenBank中猖羚皰疹病毒1型(AlHV-17GB/T42115—20227血清學(xué)診斷7.1雙抗原夾心ELISA試驗(S-ELISA)采用夾心ELISA方法檢測血清或血漿樣品中MCFV抗體：預(yù)包被高純度重組MCFV的POL抗體的存在。7.2試劑耗材7.2.3酶標抗原：HRP酶標記的MCFV基因重7.2.8八通道移液器(50pL～300μL)及相應(yīng)吸頭。7.2.996孔酶標板。7.3.1酶標儀。7.3.2恒溫培養(yǎng)箱。7.3.3洗板機。7.4試驗操作7.4.3第1次洗板棄去酶標板中液體，用工作濃度洗液洗板5次。每孔加入50μL酶標抗原，37℃溫育30min。7.4.5第2次洗板按7.4.3方法洗板。8GB/T42115—2022每孔中依次加入50μL底物溶液A液與50μL底物溶液B液，37℃下避光溫育15min。7.4.7反應(yīng)終止每一孔中加入50μL終止液。7.5試驗結(jié)果判定陽性對照OD值大于或等于1.0,并且陰性對照OD值小于0.2。臨界值：臨界值=陰性對照孔平均OD值+0.15;陽性判定：血清樣品OD值≥臨界值，判定為S-ELISA檢測陽性，表述為檢出牛惡性卡他熱血清抗體。8綜合判定8.1表現(xiàn)出4.2描述的臨床癥狀，剖檢出現(xiàn)第5章描述的病理變化的病牛，可初步判為牛惡性卡他熱可9細胞培養(yǎng)液的制備900mL的DMEM營養(yǎng)液加100mL的胎牛血清混合，配制成1000mL的溶液，加入青霉素至終A.2細胞維持液度100IU/mL,鏈霉素至終質(zhì)量濃度100μg/mA.3細胞消化液A.3.10.25%胰蛋白酶溶液的配制稱取250mg胰蛋白酶粉末，加入少許D-Hank's,將胰蛋白酶粉末調(diào)成糊狀，再補足D-Hank's至A.3.20.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的配制稱取200mg的EDTA·2Na,加D-Hank's至1L,加入酚紅15mg,用碳酸氫鈉或鹽酸調(diào)pH至7.2。高壓消毒滅菌(6.9×103Pa,121℃,15min),分裝小瓶，于4℃保存?zhèn)鋵?.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶1:1等量混合。1g鏈霉素(硫酸鹽)溶解在10mLHank's液，再用8mL鏈霉素(硫酸鹽)溶液溶解800KIU的青A.5pH7.2磷酸鹽緩沖液配制pH7.2磷酸鹽緩沖液所需試劑如下：——8g的氯化鈉(NaCl);-—1.44g的磷酸氫二鈉(Na?HPO?);——0.24g的磷酸二氫鉀(KH?PO?)。試劑加水溶解至1L,調(diào)整pH為7.2,然后高壓滅菌，室溫保存。GB/T42115—2022(規(guī)范性)牛甲狀腺細胞制備及傳代B.1牛甲狀腺原代細胞的制備B.1.1樣品處理無菌采取胎牛甲狀腺，用D-Hank's洗3次，剪成1mm3~2mm3的小塊，加入少量的細胞生長用3倍～5倍體積含0.1%～0.3%μg/mL的膠原酶組DMEM消化，37℃孵育4h,期間可振蕩B.1.3過濾洗滌消化后的細胞懸液經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過濾后，收集消化液。消化液1000r/min離心10min,棄上B.1.4培養(yǎng)細胞沉淀用細胞生長液懸浮，調(diào)整細胞濃度至0.5×10?個細胞/mL,37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24h,棄去未貼壁細胞，換細胞生長液。此時已貼壁細胞為原代牛甲狀腺細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞長成連續(xù)單層細胞。B.2牛甲狀腺細胞的傳代將已長成連續(xù)單層的原代細胞用無血清DMEM洗2次，用細胞消化液消化后加入細胞生長液重懸細胞。細胞懸液1000r/min離心10min,用細胞生長液重浮細胞，調(diào)整細胞濃度至0.5×10?個/mL,分瓶培養(yǎng)。GB/T42115—2022(規(guī)范性)病毒接種細胞出現(xiàn)病變或確知細胞內(nèi)含有豐富的病毒抗原后，用胰酶消化細胞，用PBS洗滌3次，用適量PBS懸浮細胞，將細胞懸液滴于玻片孔中。同時消化未感染病毒的同批細胞，滴加同一玻片另一孔內(nèi)，作為正常細胞對照。孔內(nèi)滴加的細胞以細胞鋪開、不重疊為宜。室溫干燥后，冷丙酮GB/T42115—2022(規(guī)范性)D.1試劑耗材D.1.1固定液：稱取6.5g的磷酸氫二鈉及4.0g的磷酸二氫鈉，加水溶解，加入100mL甲醛(40%),加水定容至1L,調(diào)整pH值為7.4。D.1.4熒光抗體：商品化的標記有熒光素或者羅丹明的抗牛免疫球蛋白。D.1.5牛惡性卡他熱陽性血清。D.1.6牛惡性卡他熱陰性血清。D.1.8蓋玻片。D.2儀器設(shè)備熒光顯微鏡。D.3操作步驟D.3.2用PBST稀釋液洗3次，每次5min,室溫干燥。D.3.3將適當稀釋的牛惡性卡他熱陽性血清、陰性血清分別滴于細胞培養(yǎng)飛片上，置濕盒內(nèi)，37℃孵育30min～45min。D.3.4用PBST稀釋液洗3次，每次5min,室溫干燥。D.3.6用PBST稀釋液洗3次，每次5min,室溫干燥。D.4結(jié)果判定D.4.1試驗成立條件D.4.2結(jié)果判定稱取54g的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、2.9mg的EDTA及27.5g的硼酸，加入滅菌雙蒸水溶稱取2g的瓊脂糖(電泳級),量取40mL的TBE電泳緩沖液(5×),加滅菌雙蒸水至200mL,微波GB/T42115—2022(資料性)PCR方法引物序列和特異性片段F.1引物序列PCR方法引物序列見表F.1。表F.1PCR方法引物序列引物引物長度序列(5'-3')擴增產(chǎn)物大小POL15'-GGC(CT)CA(CT)AA(CT)CTATGCTACTCCAC-3POL25'-ATT(AG)TCCACAAACTGTTTTGT-3'OvHVPol25'-AAAAACTCAGGGCCATTCTG-3′AlHVPol25'-CCAAAATGAAGACCATCTTA-3'注：括號中為插入的簡并堿基，這些位置的核苷酸包含括號中兩個注釋堿基中的任何一個。F.2擴增的片段序列F.2.1綿羊皰疹病毒2型(OvHV-2型)惡性卡他熱病毒第一輪擴增片段序列GGCCCACAACCTATGCTACTCCACCATTATACCCCACGAAAACCTGTCCAACI"ICCCTGACCTGACCCCGAATGACTACGAGACCTTTTTCATCAGCAGCGGGCCCGTGCACTTTGTGAAAAAGCACAAGTCCGAGTCCCTGTTGGCCAGCCTGCTGAAAACCTGGCTGGCCAAGAGGAAGGCCATCAGGAAGGAGCTGGAGCAGTGTCAGGATGAAAAACTCAGGGCCATTCTGGACAAGCAGCAGCTGGCTATCAAGGTCACGTGCAACTCGGTGTATGGGTTTACTGGAGTAGCCTCCGGCATGCTGCCCTGCCTCATGATAGCCGAGACCGTGACTCTCCAGGGCCGAACCATGTTGGAGAAGACAAAACAGTTTGTGGAAAATF.2.2猾羚皰疹病毒1型(AIHV-1型)惡性卡他熱病毒第一輪擴增片段序列GGCTCATAATCTATGCTACTCCACTCTGATCAAGCAGCAAGACCTTCCTAAATTTACCAACCTCACAGCAAATGACTATGAGACTTTTATGATAAGCGGTGGGCCTGTGCACTTTGTAAAGAAGCACAAGACTGAATCTCTGCTGGCCAGCC