土壤質(zhì)量土壤樣品直接提取DNA的方法Soilquality—Directextractionofs國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T41689—2022/ISO11 Ⅲ 1 1 1 1 25.1土壤樣品 25.2化學(xué)品 25.3緩沖液及試劑 3 37DNA提取步驟 47.1土壤樣品的準(zhǔn)備 4 47.3蛋白質(zhì)沉淀 4 47.5核酸儲存 4 48.1土壤DNA的質(zhì)量與純度 4 5 510測試報(bào)告 5附錄A(資料性)本文件與ISO11063:2012中土壤樣品直接提取DNA方法之間的差異 6附錄B(資料性)純化土壤DNA提取物的可用方法 7 8Ⅲ11范圍生物學(xué)技術(shù)[包括實(shí)時定量PCR(qPCR)]的土壤細(xì)菌群落豐度和組成分析。該方法主要適用于農(nóng)業(yè)及土壤樣品直接提取DNA為研究微生物群落a多樣性和β多樣性提供了獨(dú)特視角。通過土壤DNA下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文ISO18400-206土壤質(zhì)量采樣第206部分：實(shí)驗(yàn)室測定微生物過程、生物量與多樣性用土壤的好氧采集、處理及貯存指南(Soilquality—Sampling—Part206:Collection,handlingandstorageofsoilunderaerobicconditionsfortheassessmentofmicrobiologicalprocesses,b從土壤活體微生物提取的DNA和死亡微生物的殘留DNA。按以下提取步驟，從1g土壤樣品(等量干重)直接提取DNA。將添加了提取緩沖液和玻璃珠的土 得核酸沉淀用70%乙醇洗滌后，并溶解在分子生物學(xué)級超純水或者TE緩沖液中。通過瓊脂糖凝膠電 2ISO11063:2012(ISO11063的第1版)之間的差異列于附錄A的表A.1中。均質(zhì)(90s,4m/s)孵育(70℃,30min)離心(5min,7000g,20℃)加入3mol/L乙酸鉀(1/10體積)離心(5min,14000g,4℃)加入冷異丙醇(等體積)孵育(-20℃,30min)加入70%冷乙醇離心(5min,14000g,4℃)干燥DNA顆粒(37℃,15min)3將pH值調(diào)到8.0。4其置于1.5mL試管中進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀。剩余的裂解液可儲存在-20℃下，以便進(jìn)一步重新提取DNA。土壤DNA的質(zhì)量和長度的檢測采用1%瓊脂糖凝膠在TBE緩沖液電泳。用適當(dāng)?shù)娜旧珓?如5mg/L溴化乙錠)對凝膠進(jìn)行染色。土壤DNA純度采用分光光度法260nm波段DNA分析和5光光度法在260nm處測定土壤DNA6土壤樣品孵育離心蛋白質(zhì)沉淀乙酸鈉5mol/L(1/10體積)乙酸鉀3mol/L(1/10體積)7÷÷建議可采用ISO11063:2012[5]中實(shí)驗(yàn)室間評估使用的PVPP柱和Sepharose1)4B柱聯(lián)合法。8manceauP.,LeyvalC.,LindstromK.,PandardP.,R[2]vanElsasJ.D.,SmallaK.,TebbecleicacidsfromenvironmentabyJanssonJ.K.,vanElsasJ.D.,BaileyM.J.,LandesBioscience,Georgetown,Texas.pp.29-61.2000[3]RanjardL.,LejonD.P.H.ffungalandbacterialcommunities.Environ.Microbiol.[4]