醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)

鐘連進(jìn)

檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院/生命科學(xué)學(xué)院1分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第1頁(yè)4基因工程基因工程（DNArecombination）：又稱(chēng)DNA重組技術(shù)（geneengineering），是指將外源基因經(jīng)過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表示技術(shù)。分子克?。╩olecularcloning）：是指將目標(biāo)DNA片段與載體重組，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以取得該DNA分子大量拷貝技術(shù)。2分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第2頁(yè)4.1工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶DNA連接酶堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶核酸酶S13分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第3頁(yè)1、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）：簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶，是一類(lèi)能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列核酸水解酶。4分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第4頁(yè)第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)覺(jué)先后次序。HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株第三種酶限制性核酸內(nèi)切酶命名5分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第5頁(yè)作用ⅠⅡⅢ三種限制性核酸內(nèi)切酶作用酶活性

核酸內(nèi)切酶

核酸內(nèi)切酶

核酸內(nèi)切酶

甲基化酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶DNA鏈上無(wú)

有

有特異識(shí)別位點(diǎn)DNA鏈上無(wú)

在識(shí)別序列內(nèi)

在識(shí)別序列外特異切割位點(diǎn)在分子克隆中無(wú)

有

無(wú)主要意義6分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第6頁(yè)限制酶能識(shí)別雙鏈DNA特異4

8個(gè)堿基對(duì)，并在此序列內(nèi)特異切割DNA。限制酶功效：依據(jù)需要在特定位點(diǎn)上準(zhǔn)確切割雙鏈DNA分子?；匚慕Y(jié)構(gòu)（palindromestructure）：指雙鏈DNA分子上按對(duì)稱(chēng)軸排列反向互補(bǔ)序列（常為限制酶所識(shí)別）。限制性核酸內(nèi)切酶作用7分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第7頁(yè)5

——GAATTC——3

ATATGC5’3’EcoRⅠ識(shí)別序列：對(duì)稱(chēng)軸3

——CTTAAG——5

8分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第8頁(yè)粘性末端（stickyend）：指限制酶錯(cuò)位切開(kāi)兩條對(duì)稱(chēng)軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齊切開(kāi)兩條對(duì)稱(chēng)軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生末端。—GAATTC——CTTAAG—EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ9分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第9頁(yè)10分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第10頁(yè)11分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第11頁(yè)12分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第12頁(yè)同工異源酶（isoschizomers）：指起源不一樣，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)酶。

同尾酶（isocaudarner）：指識(shí)別序列不一樣，但能產(chǎn)生相同粘性末端酶。如：BamHⅠ和BstⅠ（GGATCC）

XhoⅠ和

PaeR7（CTCGAG）如：BamHⅠ（G

GATC

C）Sau3AⅠ（N

GATC

N）。由此產(chǎn)生DNA片段可借粘性末端相互連接，在DNA重組時(shí)含有更大靈活性。13分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第13頁(yè)1）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是單一多肽鏈多功效酶，分子量為103kD，它含有3種酶活性：①5

→3

DNA聚合酶活性②3

→5

核酸外切酶活性③5

→3

核酸外切酶活性2、DNA聚合酶14分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第14頁(yè)5

→3

外切酶5

→3

聚合酶3

→5

外切酶(103kD)Klenow片段NC5

→3

聚合酶3

→5

外切酶(68kD)35kD(小)68kD(大)N枯草桿菌蛋白酶DNA聚合酶Ⅰ15分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第15頁(yè)補(bǔ)齊雙鏈DNA3

末端，同時(shí)可使3

末端DNA標(biāo)識(shí)上同位素。cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。DNA序列分析。Klenow片段主要用途16分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第16頁(yè)TaqDNA聚合酶（簡(jiǎn)稱(chēng)Taq酶）是一個(gè)耐熱DNA聚合酶，分子量為65Kd，最正確作用溫度是70~80℃，Taq酶含有5

→3

聚合酶活性和依賴于聚合作用5

→3

外切酶活性。TaqDNA聚合酶可用于DNA測(cè)序及經(jīng)過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)DNA分子特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。

2）TaqDNA聚合酶17分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第17頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是依賴RNADNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過(guò)程稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功效酶。①RNA指導(dǎo)DNA聚合酶活性（RDDP）②核糖核酸酶H活性（RNaseH）③DNA聚合酶活性（DDDP）3）逆轉(zhuǎn)錄酶18分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第18頁(yè)5

3

3

5

RNA(用表示)RNA-DNA

雜化分子3

5

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4種dNTP

RDDP（逆轉(zhuǎn)錄酶）引物、4種dNTP病毒雙鏈DNA用

表示）（cDNA第二鏈(complementaryDNA，cDNA

)與病毒RNA互補(bǔ)DNA(用表示)5

3

3

5

5

3

5

3

19分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第19頁(yè)末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，簡(jiǎn)稱(chēng)末端轉(zhuǎn)移酶）：分子量為60Kd，在二價(jià)陽(yáng)離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子3

末端-OH上。末端轉(zhuǎn)移酶功效主要有：

在載體或目標(biāo)基因3

末端加上互補(bǔ)同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。用于DNA3

末端同位素探針標(biāo)識(shí)。4）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶20分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第20頁(yè)(A、G、C、T)nOH5′3′5′3′OH5′3′5′3′(A、G、C、T)nMg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5′3′OH5′3′OH

5′3′5′3′(A、G、C、T)nCo2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是單鏈DNA或有3

突出末端雙鏈DNA，需要Mg2+。（2）底物是平端或3

凹端雙鏈DNA，需要Co2+。(A、G、C、T)n21分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第21頁(yè)DNA連接酶（DNAligase）：稱(chēng)為基因工程縫紉針，它主要功效是催化兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端或平末端雙鏈DNA分子5

磷酸基團(tuán)與3

羥基形成磷酸二酯鍵，將含有相同粘性末端或平末端DNA連接起來(lái)。DNA連接酶包含大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶兩種類(lèi)型。3、DNA連接酶22分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第22頁(yè)23分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第23頁(yè)堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上5

-磷酸基團(tuán)。主要用途有：除去DNA片段上5

磷酸以防本身連接。在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標(biāo)識(shí)前，從RNA或DNA上除去5端磷酸。4、堿性磷酸酶

5

-pCpGpC┅┅-OH3

堿性磷酸酶5

-CpGpC┅┅-OH3

5

-p3

-HO5

-HO3

-HO24分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第24頁(yè)5、T4多核苷酸激酶5’-

CpGpC┅┅-OH3’p+ADP+ATP5’-CpGpC┅┅-OH3’T4多核苷酸激酶①前向反應(yīng)：②交換反應(yīng)：5’-CpGpC┅┅-OH3’+ADP[

-32P]dATP二硫蘇糖醇,Mg2+過(guò)量ADPT4多核苷酸激酶p*

+ATP25分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第25頁(yè)核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中單鏈部分。其主要作用有：除去粘性末端以產(chǎn)生平末端。除去cDNA合成時(shí)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。分析RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RNA分子雜交情況。6、核酸酶S1核酸酶S1核酸酶S1核酸酶S1+26分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第26頁(yè)4.2載體載體（vector）：指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表示工具。載體本質(zhì)為DNA。制備目標(biāo)基因或DNA片段必須與適當(dāng)載體連接形成重組體，才能進(jìn)入受體細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制和表示。慣用載體有：質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母質(zhì)粒和病毒等。27分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第27頁(yè)1、克隆載體克隆載體：能將載體外源DNA在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目標(biāo)DNA載體。28分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第28頁(yè)能自我復(fù)制并具較高拷貝數(shù)。分子量普通<10Kb。帶有遺傳篩選標(biāo)識(shí)。有適當(dāng)限制酶酶切位點(diǎn)，便于外源DNA插入和篩選。多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites，MCS）：載體上含有多個(gè)限制酶單一酶切位點(diǎn)。克隆載體應(yīng)具備特征29分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第29頁(yè)1）質(zhì)粒克隆載體質(zhì)?？寺≥d體主要用途：

①用于保留和擴(kuò)增<2Kb目標(biāo)DNA。②構(gòu)建cDNA文庫(kù)。③目標(biāo)DNA測(cè)序。④作為核酸雜交時(shí)探針起源。30分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第30頁(yè)pBR322質(zhì)?？寺≥d體pBR322質(zhì)粒是由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成雙鏈克隆載體，長(zhǎng)為4.36Kb。它含有一個(gè)能確保高拷貝自我復(fù)制復(fù)制起始點(diǎn)（Ori），并裝有四環(huán)素抗性（Tetr）基因和氨芐青霉素抗性（Ampr）基因供菌落篩選。在這兩個(gè)抗性基因中分別含有BamHI和PstI等限制酶單一酶切位點(diǎn)，用于插入外源DNA片段。如有外源基因插入，會(huì)造成這些標(biāo)志性基因失活。31分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第31頁(yè)復(fù)制起始點(diǎn)抗藥基因抗藥基因pBR322載體32分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第32頁(yè)pUC系列載體pUC系列載體是由pBR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構(gòu)建而成雙鏈DNA質(zhì)粒載體。pUC18和pUC19質(zhì)粒長(zhǎng)約2.69Kb，除多克隆位點(diǎn)互為相反方向排列外，其它序列均相同。pUC質(zhì)粒含Ampr，可供菌落篩選。載體中裝入一個(gè)來(lái)自大腸桿菌乳糖操縱子lacZ

基因，該基因序列中含有多克隆位點(diǎn)。33分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第33頁(yè)pUC18載體34分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第34頁(yè)2）噬菌體克隆載體噬菌體（bacteriophage，phage）：指感染細(xì)菌病毒。按其生活周期分為兩種類(lèi)型：溶菌性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，連續(xù)增殖，直到細(xì)菌裂解，釋放噬菌體又可感染其它細(xì)菌。溶原性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，可將本身DNA整合到細(xì)菌染色體中，和細(xì)菌染色體一起復(fù)制。35分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第35頁(yè)野生型

噬菌體是線性雙鏈DNA，全長(zhǎng)約48.5Kb，其中60%（約30Kb）是溶菌生長(zhǎng)所必需，中間40%區(qū)域?yàn)榉潜匦?，可被外源DNA片段代替而不影響

噬菌體生存。

噬菌體5

末端含12核苷酸互補(bǔ)單鏈次序，是天然粘性末端，稱(chēng)為cos位點(diǎn)，

噬菌體感染宿主菌后，其粘端經(jīng)過(guò)堿基配對(duì)而結(jié)合，形成環(huán)狀DNA分子。

噬菌體載體36分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第36頁(yè)

噬菌體載體結(jié)構(gòu)

37分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第37頁(yè)

噬菌體載體特點(diǎn)重組噬菌體分子量必須在野生型噬菌體75%~105%之間。篩選標(biāo)識(shí)：外源基因插入型：藍(lán)白斑(LacZ)篩選。外源基因置換型：噬菌斑數(shù)目（轉(zhuǎn)染率高100~1000倍）。38分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第38頁(yè)

噬菌體載體用途①用作普通克隆載體。②用于構(gòu)建基因組或cDNA文庫(kù)（<22Kb）。③用于抗體庫(kù)或隨機(jī)肽庫(kù)構(gòu)建。④核酸序列分析。39分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第39頁(yè)M13噬菌體野生型M13噬菌體為6.4Kb左右閉環(huán)正鏈DNA分子?？寺⊥庠椿蚱?lt;1kb。M13噬菌體能以單鏈和雙鏈兩種方式存在，可用于感染(經(jīng)包裝單鏈DNA)和轉(zhuǎn)化(雙鏈DNA)。M13中引入多克隆位點(diǎn)，恰好插入LacZ基因內(nèi)，可利用藍(lán)白色噬菌斑篩選重組體。M13噬菌體只降低宿主細(xì)胞生長(zhǎng)速度，而不溶解宿主細(xì)胞（呈溶源狀態(tài)生長(zhǎng)，故可從細(xì)菌培養(yǎng)液中取得噬菌體，制備單鏈DNA）。40分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第40頁(yè)M13噬菌體在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制模式圖噬菌體正鏈復(fù)制復(fù)制型DNA經(jīng)pII蛋白造缺口3′5′5′3′3′5′滾環(huán)復(fù)制釋出單鏈DNA(正鏈)經(jīng)pII蛋白剪切進(jìn)入下一循環(huán)41分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第41頁(yè)粘粒(cosmid)是由質(zhì)粒和

噬菌體cos位點(diǎn)構(gòu)建而成。粘粒載體組成：質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(Ori)。攜帶抗藥基因。用于插入目標(biāo)基因單一酶切位點(diǎn)。

噬菌體cos位點(diǎn)。3）粘?？寺≥d體42分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第42頁(yè)粘粒載體特點(diǎn)粘粒載體大小為4～6Kb，而插入外源基因長(zhǎng)達(dá)40～50kb。加入

噬菌體頭部和尾部蛋白，可將粘粒包裝成類(lèi)似于

噬菌體具感染能力顆粒，輕易進(jìn)入大腸桿菌。粘粒進(jìn)入細(xì)菌后則完全失去噬菌體功效，而表現(xiàn)質(zhì)粒特征。43分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第43頁(yè)粘粒載體用途①克隆大片段DNA。②構(gòu)建基因組文庫(kù)。44分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第44頁(yè)2、表示載體表示載體是指能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯載體?；虮硎尽⒑铣捎泄πУ鞍踪|(zhì)依賴于基因有效轉(zhuǎn)錄、mRNA正確翻譯和翻譯后加工。45分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第45頁(yè)匯報(bào)基因（reportergene）為了判斷某一待測(cè)DNA序列生物活性，常采取匯報(bào)基因方法。匯報(bào)基因：是指處于待測(cè)基因下游并經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和表示水平來(lái)反應(yīng)上游待測(cè)基因功效基因，又稱(chēng)報(bào)道基因。46分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第46頁(yè)1）原核細(xì)胞表示載體真核基因在原核細(xì)胞中表示需要確保外源基因：插入方向正確性；受原核開(kāi)啟子控制；必須能在原核細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和有效翻譯。外源基因在原核細(xì)胞中表示需要主要調(diào)控元件。47分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第47頁(yè)原核細(xì)胞表示載體主要是大腸桿菌表示載體。大腸桿菌表示載體是在克隆載體基礎(chǔ)上導(dǎo)入表示系統(tǒng)調(diào)控元件：開(kāi)啟子—核糖體結(jié)合位點(diǎn)—轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。48分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第48頁(yè)（1）開(kāi)啟子（promoter）如乳糖開(kāi)啟子（Lac）、色氨酸開(kāi)啟子（Trp）、Tac開(kāi)啟子（Trp-Lac）以及PL和PR開(kāi)啟子等。5

—TTGACA——TATAAT———//——3

-35區(qū)-10區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)PribnowboxDNA原核細(xì)胞開(kāi)啟子示意圖49分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第49頁(yè)（2）SD序列mRNA50分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第50頁(yè)（3）終止子（terminator）終止子：一個(gè)基因3

末端有一特定DNA序列，它含有被RNA聚合酶識(shí)別并停頓轉(zhuǎn)錄功效。該序列含有一段富含A/T和富含G/C回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，終止子轉(zhuǎn)錄后形成RNA含有莖環(huán)狀局部二級(jí)結(jié)構(gòu)。51分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第51頁(yè)-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCTTTTTTNNN-DNA-NNTTCGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN-G/C富含區(qū)2G/C富含區(qū)1A/T富含區(qū)5

3

5

3

RNA-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH5

3

RNA結(jié)構(gòu)5

GC

NNNNCCGCGCGGCGCAUAU—NNNNUUUU-OH

3

DNA轉(zhuǎn)錄強(qiáng)終止子模式圖轉(zhuǎn)錄52分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第52頁(yè)非融合型表示載體：產(chǎn)生外源蛋白，易被原核細(xì)胞蛋白酶降解。如pKK223-3質(zhì)粒載體。分泌型表示載體：產(chǎn)生帶信號(hào)肽分泌型融合蛋白，可降低外源蛋白被降解以及使蛋白質(zhì)能在細(xì)胞外正確折疊，易提取。如PINlll系列。融合型表示載體：產(chǎn)生由較短原核細(xì)胞多肽和真核細(xì)胞蛋白質(zhì)組成融合蛋白，含有抗原性，較天然外源蛋白穩(wěn)定。如pGEX系列。原核細(xì)胞表示載體類(lèi)型53分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第53頁(yè)真核表示載體真核表示元件有：開(kāi)啟子/增強(qiáng)子—終止位點(diǎn)和加polyA信號(hào)。原核質(zhì)粒序列：包含復(fù)制起始序列和抗藥基因標(biāo)識(shí)。開(kāi)啟子：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25~30bp有富含ATTATA框，TATA框上游約100~200bp處為上游開(kāi)啟子元件。增強(qiáng)子（enhancer）：是一類(lèi)顯著提升基因轉(zhuǎn)錄效率順式作用元件。終止子和加polyA信號(hào)（AAUAA）。2）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表示載體54分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第54頁(yè)目標(biāo)基因獲取載體選擇目標(biāo)基因和載體連接重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞重組體篩選和判定4.3基因工程基本步驟55分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第55頁(yè)連接含重組子陽(yáng)性克隆載體+目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化、篩選和判定陽(yáng)性克隆DNA重組體+受體細(xì)胞基因工程基本步驟——分、切、接、轉(zhuǎn)、篩56分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第56頁(yè)

1）從基因文庫(kù)中獲取2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3）人工合成DNA片段4）直接從染色體DNA中分離目標(biāo)基因1、目標(biāo)基因獲取57分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第57頁(yè)1）從基因文庫(kù)中獲取目標(biāo)基因：指被研究某一基因或DNA序列，即需要克隆或表示基因?；蚪M文庫(kù)（genomiclibrary，G-文庫(kù)）是指含有某種生物全部基因隨機(jī)片段重組DNA克隆群。58分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第58頁(yè)用逆轉(zhuǎn)錄法得到目標(biāo)基因進(jìn)行克隆，可取得較完整連續(xù)編碼序列，易在宿主細(xì)胞中表示及篩選。選取富含目標(biāo)基因mRNA細(xì)胞作為試驗(yàn)材料，有利于分離到目標(biāo)基因。如胰島素基因mRNA主要存在于胰腺組織，血紅蛋白基因mRNA占網(wǎng)質(zhì)紅細(xì)胞總mRNA50%~90%。2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA59分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第59頁(yè)依據(jù)已知基因核苷酸序列或基因產(chǎn)物氨基酸序列，可推導(dǎo)出為該多肽編碼核苷酸短序列，再用DNA合成儀人工合成目標(biāo)基因。適合用于合成分子量較小目標(biāo)基因（100bp以內(nèi)）。如：人生長(zhǎng)激素釋放因子、血管加壓素、干擾素、胸腺素及胰島素原基因等。3）人工合成DNA片段60分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第60頁(yè)依據(jù)染色體DNA限制性內(nèi)切酶圖譜，用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶切割染色體DNA、分離目標(biāo)基因。適合用于制備原核生物目標(biāo)基因，因?yàn)椋赫婧思?xì)胞染色體DNA有豐富內(nèi)含子，它們?cè)谠思?xì)胞中轉(zhuǎn)錄后不能被剪接。真核細(xì)胞基因多數(shù)為單拷貝，難以分離到足夠量目標(biāo)基因。4）直接從染色體DNA中分離目標(biāo)基因61分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第61頁(yè)依據(jù)外源DNA特征和受體細(xì)胞特征選擇適當(dāng)載體。2、載體選擇62分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第62頁(yè)1)粘性末端連接3、目標(biāo)基因和載體連接本法適合用于在質(zhì)粒和目標(biāo)基因上有相同單或雙酶切位點(diǎn)。63分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第63頁(yè)粘性末端DNA重組體構(gòu)建3

HO-G━━━━━CTTAA-p5

5

p-AATTC━━━━━G-OH

3

3

HO-G━━━━━CTTAA-p5

5

p-AATTC━━━━━

G-OH3

質(zhì)粒目標(biāo)基因

━━━━━━━━━━━━━━━━目標(biāo)基因和載體連接EcoRⅠEcoRⅠ堿性磷酸酶3

HO-G━━━━━CTTAA-OH5

5

HO-AATTC━━━━━G-OH

3

退火DNA連接酶

3

HO-G━━━━━CTTAAG━━━━━CTTAA-p5

5

p–AATTC━━━━━GAATTC━━━━━

G-OH3

64分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第64頁(yè)2)平末端連接質(zhì)粒和目標(biāo)基因上沒(méi)有相同酶切位點(diǎn)質(zhì)粒產(chǎn)生平末端內(nèi)切酶DNA連接酶目標(biāo)基因產(chǎn)生粘性末端內(nèi)切酶產(chǎn)生粘性末端內(nèi)切酶核酸酶S1核酸酶S165分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第65頁(yè)人工接頭本法適合用于在質(zhì)粒和目標(biāo)基因上沒(méi)有相同酶切位點(diǎn)。66分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第66頁(yè)本法適合用于在質(zhì)粒和目標(biāo)基因上沒(méi)有相同酶切位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)同聚尾連接67分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第67頁(yè)質(zhì)粒目標(biāo)基因

━━━━━━━━━━━━━━━━3

3

3

ACGTC━━━━━G5

5

G━━━━━CTGCA3

3

GnGGGACGTC━━━━━G5

5

G━━━━━CTGCAGGGGn3

3

CnCCC━━━━━5

5

━━━━━CCCCn3

末端轉(zhuǎn)移酶dGTP末端轉(zhuǎn)移酶dCTP混合，退火1）轉(zhuǎn)化細(xì)菌2）體內(nèi)修復(fù)同聚尾連接法構(gòu)建DNA重組體GCCCC━━━━━GGGGACGTC

CTGCAGGGG

━━━━━CCCC

G

PstⅠ

核酸外切酶目標(biāo)基因和載體連接GACGTCCTGCAGGACGTCCTGCAGCCC

━━━━━━━GGG

GGG

━━━━━━━CCCPstⅠ

PstⅠ

68分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第68頁(yè)4、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞慣用受體細(xì)胞是大腸桿菌。轉(zhuǎn)化（transformation）：是指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建重組子導(dǎo)入細(xì)菌過(guò)程。感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并含有攝取外源DNA能力細(xì)胞。69分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第69頁(yè)制備感受態(tài)細(xì)胞基本方法CaCl2處理，增加大腸桿菌細(xì)胞膜通透性。電擊法，高壓脈沖使細(xì)胞膜形成暫時(shí)性微孔。70分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第70頁(yè)1）重組體篩選依據(jù)載體抗藥性標(biāo)志篩選

大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性基因（如Ampr、Tetr等），當(dāng)帶有完整抗性基因載體轉(zhuǎn)化無(wú)抗性細(xì)菌后，被轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌取得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應(yīng)排除未重組空載體。5、重組體篩選和判定71分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第71頁(yè)依據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇一些質(zhì)粒載體如pBR322質(zhì)粒中有Ampr和Tetr

抗性基因，在這兩個(gè)基因中裝有幾個(gè)慣用MCS，如將外源DNA片段插入BamHⅠ識(shí)別序列時(shí)，則此質(zhì)粒由Tetr變?yōu)閷?duì)四環(huán)素敏感（Tets）。這種重組子導(dǎo)入宿主菌后，宿主菌在含四環(huán)素瓊脂糖平皿上不能生長(zhǎng)而在含氨芐青霉素平皿上能夠生長(zhǎng)。在含四環(huán)素和氨芐青霉素平皿上都能夠生長(zhǎng)細(xì)菌只含有空載體，此篩選方法稱(chēng)為雙抗生素篩選法。72分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第72頁(yè)雙抗生素篩選法73分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第73頁(yè)

-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍(lán)白斑篩選法）一些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子lacZ

基因，該基因含一段編碼

-半乳糖苷酶氨基末端145個(gè)氨基酸

-肽DNA片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼缺點(diǎn)型

-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)

-互補(bǔ)，形成完整

-半乳糖苷酶，催化指示劑底物X-gal形成藍(lán)色產(chǎn)物，結(jié)果重組克隆呈藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ

基因中MCS，lac

-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無(wú)

-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落，這是慣用藍(lán)白斑篩選法。74分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第74頁(yè)75分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第75頁(yè)依據(jù)插入外源性基因性狀進(jìn)行篩選當(dāng)細(xì)胞生物合成路徑中某個(gè)酶編碼基因失活后，該細(xì)胞成為營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型，如導(dǎo)入細(xì)胞重組DNA能填補(bǔ)缺點(diǎn)基因，那么培養(yǎng)基中就不需補(bǔ)充相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成份，由此可挑選出含重組DNA陽(yáng)性細(xì)菌。76分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第76頁(yè)核酸雜交技術(shù)篩選將轉(zhuǎn)化細(xì)菌平板轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，應(yīng)用特異性核酸探針對(duì)其進(jìn)行原位雜交，可篩選出陽(yáng)性克隆。對(duì)于噬菌體載體克隆，此法也可經(jīng)過(guò)噬菌斑原位雜交篩選陽(yáng)性克隆。經(jīng)過(guò)斑點(diǎn)雜交和Southernblot雜交技術(shù)篩選。77分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第77頁(yè)2）重組體判定依據(jù)重組子大小判定重組子裝有外源DNA，分子量較原載體大得多，從挑選菌落中分別提取重組DNA和原載體DNA，直接進(jìn)行電泳，原載體DNA分子量較小、電泳遷移率較大；而重組DNA因分子量較大而遷移率較小。78分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第78頁(yè)酶切判定分別提取重組載體DNA和原載體DNA，依據(jù)已知外源基因兩端酶切位點(diǎn)，分別用對(duì)應(yīng)內(nèi)切酶進(jìn)行切割，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，只出現(xiàn)一條區(qū)帶是原載體本身，而重組載體還多一條外源DNA片段區(qū)帶，可依據(jù)DNAmark來(lái)分析插入DNA片段分子量。79分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第79頁(yè)P(yáng)CR判定提取重組子DNA，利用插入外源基因兩端互補(bǔ)特異引物，對(duì)重組子DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。此法不但可分離擴(kuò)增目標(biāo)基因，還可對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序。80分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第80頁(yè)DNA序列分析判定DNA序列分析是確定分離DNA是否是特異外源性插入DNA唯一方法（金標(biāo)準(zhǔn)），也是最確定方法。自動(dòng)化，快速、簡(jiǎn)便和實(shí)用。81分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第81頁(yè)8核酸分子雜交8.1核酸雜交基本原理8.2核酸探針技術(shù)8.3核酸分子雜交技術(shù)8.4基因芯片82分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第82頁(yè)核酸定性或定量檢測(cè)基因克隆、突變及其表示研究疾病臨床診療主要用途83分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第83頁(yè)8.1核酸雜交基本原理核酸變性核酸復(fù)性核酸分子雜交84分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第84頁(yè)8.1.1核酸變性變性（denaturation）：在一些理化原因作用下，維系DNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過(guò)程?；瘜W(xué)鍵改變：維持雙螺旋穩(wěn)定氫鍵和疏水鍵發(fā)生斷裂，斷裂能夠是部分或全部，能夠是可逆或是非可逆?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)改變：DNA變性改變了其空間結(jié)構(gòu)，不包括到其一級(jí)結(jié)構(gòu)改變。85分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第85頁(yè)86分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第86頁(yè)DNA變性原因凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性原因都能夠成為變性條件。加熱極端pH有機(jī)試劑（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）87分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第87頁(yè)變性DNA理化性質(zhì)溶液黏度降低：DNA雙螺旋是緊密“剛性”結(jié)構(gòu)，變性后代之以“柔軟”無(wú)規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA黏度顯著下降。溶液旋光性發(fā)生改變：變性后DNA分子對(duì)稱(chēng)性及局部構(gòu)型改變。紫外吸收增加：DNA變性后，DNA溶液紫外吸收增強(qiáng)。雙鏈DNA＜單鏈DNA＜單核苷酸88分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第88頁(yè)增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高現(xiàn)象。89分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第89頁(yè)解鏈曲線通常利用DNA變性后在波長(zhǎng)260nm處吸光度（A260）增加來(lái)監(jiān)測(cè)DNA變性過(guò)程。假如以溫度對(duì)A260關(guān)系作圖，所得曲線稱(chēng)為解鏈曲線。經(jīng)典DNA變性曲線呈S型。90分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第90頁(yè)融解溫度融解溫度（meltingtemperature，Tm）：在熱變性過(guò)程中，紫外吸收值到達(dá)最大值50%時(shí)溫度稱(chēng)為DNA解鏈溫度或融解溫度。暴發(fā)式：熱變性是在變性溫度范圍內(nèi)突發(fā)躍變過(guò)程，很像結(jié)晶到達(dá)熔點(diǎn)時(shí)融化現(xiàn)象，故名融解溫度。狹窄性：變性溫度范圍很小。91分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第91頁(yè)Tm影響原因DNA分子大小和堿基組成溶液離子強(qiáng)度pH值變性劑92分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第92頁(yè)1、DNA分子大小和堿基組成DNA均一性堿基組成均一性樣品組成均一性DNA（G+C）含量93分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第93頁(yè)DNA（G+C）含量在溶劑固定前提下，Tm值高低取決于DNA分子中（G+C）含量。（G+C）含量越高，G-C堿基對(duì)越多，Tm值越高。核苷酸≤20bp：Tm=4（G+C）+2（A+T）94分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第94頁(yè)95分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第95頁(yè)2、溶液離子強(qiáng)度溶液中離子與DNA分子中磷酸基團(tuán)形成離子鍵，需要較高溫度才能使DNA變性。離子強(qiáng)度較低時(shí)，Tm值較低，而且解鏈溫度范圍也較寬。96分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第96頁(yè)3、pH值pH值影響氫鍵形成。pH值在5-9范圍內(nèi)，Tm值改變不顯著。pH值小于4或大于11時(shí)，均不利于氫鍵形成，DNA輕易變性。97分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第97頁(yè)4、變性劑干擾堿基堆積力和氫鍵形成，所以能夠降低Tm值。慣用變性劑有甲酰胺、尿素、甲醛等。

98分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第98頁(yè)8.1.2核酸復(fù)性復(fù)性（renaturation）：指變性DNA在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)現(xiàn)象，它是變性一個(gè)逆轉(zhuǎn)過(guò)程。退火（annealing）：熱變性DNA普通經(jīng)遲緩冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱(chēng)之為“退火”。雙鏈DNA、RNA雙鏈區(qū)、DNA:RNA雜交雙鏈以及其它異源雙鏈核酸分子都含有此性質(zhì)。99分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第99頁(yè)核酸復(fù)性影響原因溫度和時(shí)間DNA濃度DNA分子大小和復(fù)雜度離子強(qiáng)度100分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第100頁(yè)1、溫度和時(shí)間普通認(rèn)為比Tm低25℃左右溫度是復(fù)性最正確條件，越遠(yuǎn)離此溫度，復(fù)性速度就越慢。復(fù)性時(shí)溫度下降必須是一遲緩過(guò)程，若在超出Tm溫度下快速冷卻至低溫（如4℃以下），復(fù)性幾乎是不可能。101分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第101頁(yè)2、DNA濃度DNA復(fù)性第一步是兩個(gè)單鏈分子間相互作用“成核”?！俺珊恕彼俣扰cDNA濃度平方成正比。溶液中DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合“成核”機(jī)會(huì)越大。102分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第102頁(yè)3、DNA分子大小和復(fù)雜度用非重復(fù)堿基對(duì)（bp）數(shù)表示核酸分子復(fù)雜性。簡(jiǎn)單次序DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）這二種單鏈序列復(fù)性時(shí)，互補(bǔ)堿基配對(duì)較易實(shí)現(xiàn)。次序復(fù)雜DNA，如小牛DNA非重復(fù)部分（普通以單拷貝存在于基因組中），這種復(fù)雜特定序列要實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，顯然要比上述簡(jiǎn)單序列困難得多。103分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第103頁(yè)4、離子強(qiáng)度對(duì)復(fù)性影響增加鹽濃度可增加互補(bǔ)鏈合成雙鏈速度，鹽中和DNA單鏈中磷酸基團(tuán)負(fù)電荷，降低互補(bǔ)鏈靜電排斥。104分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第104頁(yè)8.1.3核酸分子雜交核酸分子雜交（molecularhybridization）:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補(bǔ)標(biāo)準(zhǔn)締合成異質(zhì)雙鏈過(guò)程稱(chēng)為分子雜交或核酸分子雜交。105分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第105頁(yè)雜交本質(zhì)：就是在一定條件下使互補(bǔ)核酸鏈實(shí)現(xiàn)復(fù)性。利用探針（probe）與靶DNA雜交，可識(shí)別靶DNA中特異核苷酸序列。106分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第106頁(yè)5.2.2核酸探針技術(shù)核酸探針（nucleicacidprobe)：是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)雜交，雜交后可用特殊方法檢測(cè)已知被標(biāo)識(shí)核酸分子。107分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第107頁(yè)選擇探針基本標(biāo)準(zhǔn)高度特異性探針起源是否方便制備探針難易程度108分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第108頁(yè)8.2.1核酸探針類(lèi)型基因組DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針109分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第109頁(yè)起源：這類(lèi)探針起源于某種生物基因組，多為某一基因全部或部分序列。制備方法:基因克隆方法聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)特點(diǎn):多克隆在載體中DNA片段，可無(wú)限繁殖，取之不盡。PCR制備探針簡(jiǎn)便和省時(shí)。相對(duì)RNA而言，DNA探針不易降解，標(biāo)識(shí)方法也較成熟。1、基因組DNA探針110分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第110頁(yè)cDNA(complementaryDNA)：是指與mRNA互補(bǔ)DNA分子。特點(diǎn):不存在內(nèi)含子和高度重復(fù)序列，是一個(gè)較理想核酸探針，尤其是用于基因表示研究。排除了RNA酶影響，現(xiàn)已成為分子生物學(xué)試驗(yàn)室常規(guī)試驗(yàn)。cDNA探針111分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第111頁(yè)RNA探針與靶序列雜交效率較高，穩(wěn)定性也高。RNA分子大多以單鏈形式存在，幾乎不存在互補(bǔ)雙鏈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。RNA分子中不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交少，雜交后未雜交探針?lè)肿铀饪捎肦NA酶去除，本底干擾低。RNA探針有易降解和標(biāo)識(shí)方法復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用。

RNA探針112分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第112頁(yè)依據(jù)需要來(lái)合成對(duì)應(yīng)核酸序列，防止天然探針缺點(diǎn)。探針長(zhǎng)度普通為10～50bp。尤其適合點(diǎn)突變檢測(cè)。因?yàn)樘结橀L(zhǎng)度較短，特異性較低，雜交信號(hào)較弱，但經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)仍可設(shè)計(jì)出非常特異寡核苷酸探針。寡核苷酸探針113分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第113頁(yè)探針長(zhǎng)度：普通要求在10～50bp。

G／C含量為40％～60％。探針?lè)肿又袘?yīng)防止互補(bǔ)序列。防止同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，普通不能多于4個(gè)，如GGGG-或-CCCC-。借助計(jì)算機(jī)對(duì)應(yīng)軟件與已知各種基因序列進(jìn)行同源性比較。探針設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)114分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第114頁(yè)理想探針標(biāo)識(shí)物應(yīng)含有以下特點(diǎn)：檢測(cè)物要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便。標(biāo)識(shí)物與探針結(jié)合后，應(yīng)不影響雜交反應(yīng)，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值。標(biāo)識(shí)物對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無(wú)損傷，價(jià)格低廉。標(biāo)識(shí)物對(duì)檢測(cè)方法無(wú)干擾。

8.2.2核酸探針標(biāo)識(shí)和檢測(cè)115分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第115頁(yè)慣用核酸探針標(biāo)識(shí)和檢測(cè)標(biāo)識(shí)分子標(biāo)識(shí)方法檢測(cè)方法[α32P]dNTPNT、PCR、RP放射自顯影或液閃計(jì)數(shù)[γ32P]dNTPTL放射自顯影或液閃計(jì)數(shù)35SNT放射自顯影或液閃計(jì)數(shù)3HNT放射自顯影或液閃計(jì)數(shù)Bio-11-dUTPNT、PCR、RP酶標(biāo)親和素或酶標(biāo)抗體顯色光敏生物素可見(jiàn)光照射酶標(biāo)親和素或酶標(biāo)抗體顯色生物素化補(bǔ)骨脂素紫外線照射酶標(biāo)親和素或酶標(biāo)抗體顯色HRP和ALP化學(xué)法或直接法酶促底物顯色FITC和羅丹明合成法熒光顯微鏡觀察地高辛RP、NT酶標(biāo)抗體+底物顯色116分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第116頁(yè)8.3核酸分子雜交技術(shù)5.2.3.1固相核酸分子雜交5.2.3.2原位核酸分子雜交5.2.3.3液相核酸分子雜交5.2.3.4核酸分子雜交試驗(yàn)條件優(yōu)化

117分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第117頁(yè)分子雜交技術(shù)普通流程探針制備及標(biāo)識(shí)（同位素或非同位素）待測(cè)核酸樣品制備（分離，純化）雜交（液相，固相，原位雜交）雜交后處理（去掉非特異雜交分子）顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）結(jié)果分析118分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第118頁(yè)核酸分子雜交技術(shù)類(lèi)型

雜交類(lèi)型檢測(cè)對(duì)象Southern印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上DNA分子Northern印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上RNA分子菌落雜交檢測(cè)固定在膜上，經(jīng)裂解從細(xì)菌體釋放DNA分子正向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)固定在膜上DNA或RNA分子反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)樣品中DNA或RNA分子微板雜交檢測(cè)固定微板孔上DNA或RNA分子原位雜交檢測(cè)細(xì)胞或組織上DNA或RNA分子119分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第119頁(yè)固相分子雜交：是將待測(cè)靶核苷酸鏈預(yù)先固定在固體支持物上，然后放入含有標(biāo)識(shí)探針雜交液中，進(jìn)行雜交反應(yīng)后，使雜交分子留在支持物上，故稱(chēng)固體雜交。固體雜交優(yōu)點(diǎn)：未雜交游離探針經(jīng)過(guò)漂洗可輕易除去，膜上雜交分子輕易檢測(cè)，還能預(yù)防靶DNA自我復(fù)性，所以被廣泛應(yīng)用。8.3.1固相核酸分子雜交120分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第120頁(yè)DNA變性中和Southern印跡預(yù)雜交雜交洗膜檢測(cè)

1、Southern印跡雜交（Southernblot）121分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第121頁(yè)

毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖122分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第122頁(yè)電轉(zhuǎn)移示意圖123分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第123頁(yè)Northern印跡雜交是應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA一個(gè)膜上印跡技術(shù)。是由Alwine于1977年建立，后經(jīng)Thomas等人改進(jìn)。用于分析mRNA分子大小及mRNA轉(zhuǎn)錄情況。2、Northern印跡雜交（Northernblot）124分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第124頁(yè)Northern印跡雜交流程圖

125分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第125頁(yè)與Southern印跡雜交不一樣點(diǎn)RNA提取過(guò)程中需尤其注意RNA酶污染。所用器材最好與Southern印跡試驗(yàn)分開(kāi)使用。RNA變性方法：不能用堿變性，因?yàn)閴A會(huì)水解RNA2‘-羥基基團(tuán)，在變性劑存在下進(jìn)行電泳，預(yù)防RNA分子形成發(fā)夾式二級(jí)結(jié)構(gòu)，以保持其單鏈線形狀態(tài)。印跡前將含變性劑凝膠用水沖洗掉，再印跡、雜交。假如測(cè)定RNA片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)識(shí)物一同電泳，之后將標(biāo)識(shí)物切下、上色、照像，樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印。126分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第126頁(yè)斑點(diǎn)雜交是將待檢樣品（DNA、RNA或細(xì)胞）直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定。3、斑點(diǎn)雜交（Dot-blot）127分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第127頁(yè)斑點(diǎn)雜交不需電泳和轉(zhuǎn)膜過(guò)程，整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)便、快速。但結(jié)果無(wú)法判斷核酸片段大小，也無(wú)法判斷樣品溶液中是否存在著不一樣靶序列。多用作核酸定性或半定量分析，而且便于雜交條件探索。128分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第128頁(yè)菌落雜交示意圖4、菌落雜交129分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第129頁(yè)微板酶聯(lián)夾心雜交動(dòng)畫(huà)流程N(yùn)OS基團(tuán)捕捉探針PCR產(chǎn)物檢測(cè)探針親和素-HRP四甲基聯(lián)苯氨氨基生物素5、微板酶聯(lián)雜交130分子生物學(xué)基因工程和核酸雜交第130頁(yè)捕捉探針共價(jià)結(jié)合在