ICS11.040.01YY/T0879.2—2015醫(yī)療器械致敏反應(yīng)試驗(yàn)第2部分：小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)BrdU-ELISA法國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布IYY/T0879.2—2015——第1部分：小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA);——第2部分：小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)BrdU-ELISA法。本部分為YY/T0879的第2部分。本部分按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本部分由國家食品藥品監(jiān)督管理總局提出。本部分由全國醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC248)歸口。ⅡYY/T0879.2—2015YY/T0879.1中使用放射性摻入胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷的方法來檢測醫(yī)療器械的致敏潛能，可用來部分替代GB/T16886.10中規(guī)定的豚鼠致敏試驗(yàn)。但是在放射性物質(zhì)的購買、使用或廢物處理與YY/T0879.1相似，本部分研究皮膚致敏的誘導(dǎo)階段并提供適用于劑量反應(yīng)評定的定量數(shù)據(jù)。并且，可以不使用對DNA有放射性的標(biāo)記，消除了放射性職業(yè)暴露和廢物處理問題。同時(shí)，本部皮膚致敏試驗(yàn)中豚鼠的使用量要少，不需要皮內(nèi)致敏反應(yīng)的挑戰(zhàn)誘導(dǎo)階段的激發(fā)。并且不需要像豚鼠本部分不一定適用于所有的試驗(yàn)物質(zhì)。比如對某些金屬試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)由于表面含有某些皮膚刺激有表明作為潛在混雜因素的官能團(tuán)的物質(zhì)可能還需要使用豚鼠致敏試驗(yàn)。同時(shí)，YY/T0879.1中識別括試驗(yàn)物質(zhì)的名稱和化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化特性、任何其他體外或體內(nèi)毒性試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)構(gòu)相關(guān)的毒理學(xué)數(shù)同的數(shù)據(jù)組來設(shè)定SI值并用來計(jì)算該試驗(yàn)的識別能力，所描述的結(jié)果可能會高估1YY/T0879.2—2015醫(yī)療器械致敏反應(yīng)試驗(yàn)第2部分：小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)BrdU-ELISA法YY/T0879的本部分給出了醫(yī)療器械或材料致敏反應(yīng)的試驗(yàn)方法。性進(jìn)行確認(rèn)。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T16886.1醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中的評價(jià)與試驗(yàn)GB/T16886.2醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第2部分：動物福利要求GB/T16886.10醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第10部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)GB/T16886.12醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第12部分：樣品制備與參照樣品3術(shù)語和定義GB/T16886.1、GB/T16886.2和GB/T16886.10界定的術(shù)語和定義適用于本文件。醫(yī)療器械中的致敏劑可誘導(dǎo)作用位點(diǎn)的引流淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞的增殖。該增殖與所使用的致敏劑的劑量和致敏潛能成比例，從而提供了一種簡單的獲取定量測量致敏性的方法。BrdU是胸腺嘧啶核苷的類似物并可摻入增殖細(xì)胞的DNA之中。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法測量試驗(yàn)動物耳部引流淋巴結(jié)內(nèi)摻入BrdU的量來指示增殖細(xì)胞的數(shù)量增加，并用試驗(yàn)組與對照組的平均增殖量之比本試驗(yàn)選擇的動物種屬為小鼠。CBA/JN是優(yōu)先推薦的品系。宜使用成年未生育過且未受孕的雌性CBA/JN小鼠，8周齡～12周齡。在試驗(yàn)開始時(shí)，動物體重應(yīng)不超過平均體重的±20%。當(dāng)有充分?jǐn)?shù)據(jù)證實(shí)在本試驗(yàn)中無品系和/或性別特異性差異時(shí)，也可以選擇其他品系或雄性動物，如BALB/c2YY/T0879.2—2015所有的動物試驗(yàn)應(yīng)在經(jīng)國家認(rèn)可機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)并符合實(shí)驗(yàn)室動物福利全部適用法規(guī)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并且還應(yīng)符合GB/T16886.2的要求。隨機(jī)選擇動物，進(jìn)行個(gè)體標(biāo)記(但不能進(jìn)行耳部標(biāo)記),并于試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)至少5d。試驗(yàn)前檢查所有動物以確保無明顯的皮膚損害。宜根據(jù)GB/T16886.12的原則，制備試驗(yàn)溶液。液體試驗(yàn)物質(zhì)可直接使用或稀釋使用。對于醫(yī)療6可靠性檢查6.1陽性對照是通過用已進(jìn)行充分表征的致敏試驗(yàn)物質(zhì)來證實(shí)試驗(yàn)的適宜性，該物質(zhì)具有適宜的可重復(fù)的高致敏性。當(dāng)需要證實(shí)實(shí)驗(yàn)室成功進(jìn)行每個(gè)試驗(yàn)的能力并能開展實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)6.2對于經(jīng)常進(jìn)行試驗(yàn)(頻率不少于每月一次)并具有長期開展陽性對照數(shù)據(jù)來證實(shí)具有獲得可重復(fù)的和準(zhǔn)確的陽性結(jié)果能力的實(shí)驗(yàn)室，可以周期性地(間隔≤6個(gè)月)進(jìn)行陽性對照試驗(yàn)。在期望給出增重皮膚刺激或系統(tǒng)毒性為宜并且誘導(dǎo)反應(yīng)具有可重復(fù)性(如SI>14被認(rèn)為是嚴(yán)重反應(yīng))。6.3雖然陽性對照試驗(yàn)物質(zhì)宜在已知能激發(fā)持續(xù)反應(yīng)的介質(zhì)中進(jìn)行試驗(yàn)(如，丙酮：橄欖油體積比為4:1),但可能有某些法規(guī)要求試驗(yàn)樣品在非標(biāo)準(zhǔn)的介質(zhì)(臨床/化學(xué)相關(guān)的成分)中進(jìn)行試驗(yàn)。如果陽推薦使用的陽性對照試驗(yàn)物質(zhì)是：丙酮體積：橄欖油體積為4:1的混合液中含25%的己基肉桂醛(CAS[101-86-0])和25%丁子香酚(CAS[97-53-0])。也可使用其他經(jīng)過充分論證的陽性對照試驗(yàn)用所制備的最高濃度的化學(xué)溶液、懸浮液或浸提液。如需要可檢驗(yàn)系列劑量(稀釋液)。全身毒性和重8.1.2試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)組、一個(gè)陰性對照組和一個(gè)陽性對照組。每組至少使用四只動物。3YY/T0879.2—2015當(dāng)試驗(yàn)采用周期陽性對照時(shí)，宜特別考慮進(jìn)行陽性對照的多劑量試驗(yàn)。除了不用試驗(yàn)物質(zhì)進(jìn)行處理以8.1.3如需要檢驗(yàn)系列劑量時(shí)，宜從適宜的系列濃度中選擇連續(xù)劑量，如100%、50%、25%、10%、5%、2.5%、1%和0.5%等。系列濃度的選擇宜加以科學(xué)論述。在選擇三個(gè)連續(xù)的濃度時(shí)，宜考慮所有現(xiàn)有的試驗(yàn)物質(zhì)的毒理學(xué)信息(如急性毒性和皮內(nèi)刺激)、結(jié)構(gòu)和理化信息(和/或試驗(yàn)物質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)),使得8.1.4介質(zhì)不宜干擾試驗(yàn)結(jié)果或使試驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏倚，并建立在試驗(yàn)物質(zhì)最大溶解度的基礎(chǔ)之上，以獲取試驗(yàn)物質(zhì)在應(yīng)用中的最高濃度。推薦的介質(zhì)為丙酮與橄欖油體積比為4:1的混合液、N,N-二甲水性介質(zhì)。8.2.1當(dāng)缺少確定試驗(yàn)最高劑量的信息時(shí)，宜進(jìn)行預(yù)篩選試驗(yàn)以確定適宜的試驗(yàn)劑量水平。當(dāng)缺少引試驗(yàn)劑量水平宜為最大可能的浸提濃度。8.2.2除了沒有對淋巴結(jié)增殖的評定和每組使用動物較少以外，預(yù)篩選試驗(yàn)在與主試驗(yàn)相同的條件下進(jìn)行。推薦每個(gè)劑量組使用1只～2只動物。8.2.3每日觀察所有動物的任何全身毒性或應(yīng)用部位的局部刺激的臨床體征。實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束時(shí)(第6天)記錄體重。觀察每只小鼠雙耳的紅斑情況并用表1進(jìn)行記分。在第1天(處理前)、第3天(第1次處理后大約48h)和第6天用厚度儀進(jìn)行耳厚度測量(如千分尺或測厚儀)。另外，第6天，以人道方式處死動物后，可以用耳打孔機(jī)進(jìn)行耳厚度加權(quán)測量。任何一天測量得到紅斑記分≥3和/或耳厚度增加≥25%就表明嚴(yán)重局部刺激。選擇預(yù)篩選試驗(yàn)系列濃度中下一個(gè)不引起全身毒性和/或嚴(yán)重局部皮膚刺激的較低的劑量作為主試驗(yàn)最高劑量。注1:除了耳部厚度增加25%以外，試驗(yàn)組小鼠耳部厚度與對照組相比有統(tǒng)計(jì)意義的增加也曾經(jīng)被用來識別LLNA中的刺激劑。然而，當(dāng)耳部厚度增加小于25%時(shí)可能況的厚度增加尚未與嚴(yán)重刺激有關(guān)聯(lián)。評價(jià)中宜考慮無活力和/或無反應(yīng)性體征和超過輕微或瞬時(shí)疼痛和痛苦的任何臨床體征、或從第1天~第6天體重減少超過5%、死亡率。宜以人道方式處死瀕死動物或具有嚴(yán)重疼痛和痛苦體征的動物。無紅斑0極輕微紅斑(僅能察覺)明顯紅斑2中度到重度紅斑3重度紅斑(鮮紅)到焦痂形成不能進(jìn)行紅斑分級44YY/T0879.2—2015a)第1天：單獨(dú)識別和記錄每只動物的體重和任何臨床觀察結(jié)果。在每只小鼠耳部涂敷25μLb)第2天和第3天：記錄每只動物的任何臨床觀察結(jié)果。在每只小鼠耳部涂敷25μL適宜稀釋c)第4天：不作處理。d)第5天：腹腔注射0.5mL(5mg/鼠)的BrdU(10mg/mL)溶液。e)第6天：記錄每只動物體重和任何臨床觀察結(jié)果。在BrdU注射后大約24h,以人道方式處死動物。從小鼠耳部剪除引流淋巴結(jié)并分別對每只動物的引流淋巴結(jié)在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行處耳厚度測量等(解剖時(shí)通過千分尺或測厚儀測量)。解的方式或其他可接受技術(shù)(如使用一次性塑料棒和70#尼龍網(wǎng))來制備成淋巴結(jié)細(xì)胞(LNC)單細(xì)胞懸陰性對照組小鼠淋巴結(jié)非常小，因此小心操作對避免人為因素對SI值的影響非常重要。在每次試驗(yàn)中，淋巴結(jié)細(xì)胞懸液的靶體積宜調(diào)整至一個(gè)最佳體積(如CBA/JN小鼠大約15mL)。該最佳體積是基于使陰性對照組得到0.1～0.2的平均吸光度。8.5細(xì)胞增殖的測定(淋巴細(xì)胞DNA中BrdU的測量)質(zhì)溶液進(jìn)行反應(yīng)使之產(chǎn)生色原體。然后按說明書推薦的波長測量吸光值。宜使所有的實(shí)驗(yàn)條件達(dá)到最佳。宜至少每天仔細(xì)觀察一次每只動物的任何臨床體征和作用部位的局部刺激或全身毒性，并記錄并保存每只小鼠所有的觀察結(jié)果。試驗(yàn)方案中宜包括出現(xiàn)全身毒性、嚴(yán)重局部皮膚刺激或皮膚腐蝕小鼠需安樂處死的快速識別準(zhǔn)則。9.2體重宜按7.3在試驗(yàn)開始和人道方式處死時(shí)測量每只試驗(yàn)動物的體重。每組處理結(jié)果以平均刺激指數(shù)(SI)表示。SI等于每個(gè)試驗(yàn)組和陽性對照組的平均BrdU標(biāo)記指數(shù)除以陰性對照組的平均BrdU標(biāo)記指數(shù)。陰性對照組的平均SI值為1。BrdU標(biāo)記指數(shù)：5YY/T0879.2—2015B=(A?—A?)—(A?—A?)B——BrdU標(biāo)記指數(shù)；A?——發(fā)射波長吸光度；A?——空白發(fā)射波長吸光度；A?——參考波長吸光度；A?——空白參考波長吸光度。對數(shù)據(jù)中存在的劑量-反應(yīng)關(guān)系和程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。任何統(tǒng)計(jì)學(xué)評定都可以包含劑量-反應(yīng)關(guān)系的評價(jià)和試驗(yàn)組適當(dāng)調(diào)整后的比較(如劑量組與陰性對照組的成對比較)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以包括，線性回歸或威廉姆斯試驗(yàn)來評定劑量-反應(yīng)趨勢，以及用Dunnett's試驗(yàn)進(jìn)行成對比較。在選擇一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方11結(jié)果的解釋11.1當(dāng)SI≥1.6時(shí)認(rèn)為是陽性結(jié)果。然而，處于臨界情況時(shí)(SI值在1.6～1.9之間),也可用陰性對照11.2對于SI在1.6～1.9之間的臨界陽性反重刺激的證據(jù)和SI值的統(tǒng)計(jì)學(xué)(適用時(shí)),來確定其是否為陽性結(jié)果。還宜考慮試驗(yàn)物質(zhì)的各種特性，包括其是否與已知皮膚致敏劑具有結(jié)構(gòu)關(guān)系，是否導(dǎo)致小鼠嚴(yán)重皮膚刺激以及觀察到的劑量-反應(yīng)12數(shù)據(jù)和報(bào)告宜以表格形式匯總單只動物的BrdU標(biāo)記指數(shù)值，組平均BrdU標(biāo)記指數(shù)/動物，有關(guān)試驗(yàn)報(bào)告宜包含下列信息：a)試驗(yàn)物質(zhì)和對照試驗(yàn)物質(zhì)：3)成分和成分的相對百分含量(如有配方)。2)浸提介質(zhì)選擇的說明。c)試驗(yàn)動物：6YY/T0879.2—20153)動物的數(shù)量和年齡；d)試驗(yàn)條件：1)ELISA試劑盒的來源、批號和制造商的質(zhì)量保證/質(zhì)量控制數(shù)據(jù)(抗體敏感性和特異性以及檢測限);2)試驗(yàn)物質(zhì)制備和應(yīng)用的詳細(xì)信息；6)處理和制樣方案的詳細(xì)信息；7)毒性的檢測方法；8)考慮陽性或陰性研究準(zhǔn)則；9)任何方案偏離的詳細(xì)信息和偏離對研究設(shè)計(jì)和結(jié)果影響的解釋。e)可靠性檢查(必要時(shí))