磷酸化標記核酸檢測通則國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T39512—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由全國生化檢測標準化技術委員會(SAC/TC387)提出并歸口。本標準起草單位：中國測試技術研究院生物研究所、通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司、四川省亞中基因科技有限責任公司、深圳市計量質(zhì)量檢測研究院、中國測試技術研究院、成都先導藥業(yè)開發(fā)股份有限1GB/T39512—2020磷酸化標記核酸檢測通則1范圍本標準適用于DNA編碼化合物文庫構建用的磷酸化標記核酸的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T30988多酚類植物基因組DNA提取純化及測試方法GB/T30989高通量基因測序技術規(guī)程GB/T34797核酸引物探針質(zhì)量技術要求3術語和定義GB/T34797界定的以及下列術語和定義適用于本文件。磷酸化標記核酸phosphorylationlabelednucleicacid5'端標記一個磷酸基團，長度范圍在9nt～17nt的單鏈DNA。DNA編碼化合物DNAencodedcompound具有5'端標記磷酸基團，3'端帶有2～6個堿基黏末端，9nt～17nt的兩條單鏈DNA退火形成的退火annealing兩條單鏈DNA通過加熱變性、降溫復性的方式，依據(jù)堿基互補配對原則結合在一起。3.4互補鏈complementarystrand通過堿基互補配對形成的雙鏈核苷酸鏈中的兩條單鏈。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DIEA:N,N-二異丙基乙胺(Diisopropylethylamine)DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)EDTA:乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetraaceticAcid)2GB/T39512—2020HFIPA:六氟異丙醇(Hexafluoroisopropanol)HPLC:高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography)LC-MS:液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LiquidChromatography-MassSpectrometer)OD:光密度(OpticalDensity)TEAA:三乙基銨醋酸鹽(TriethylammoniumAcetate)5磷酸化標記核酸檢測一般要求5.2人員要求磷酸化標記核酸的檢測項目參見表1,指標參數(shù)的參考結果參見附錄A。樣品指標項目測定方法儀器設備磷酸化標記核酸總量紫外分光光度計相對分子質(zhì)量堿基準確度測序儀純度紫外吸收強度紫外分光光度計HPLC純度質(zhì)譜純度堿基缺失率完全匹配度測序儀堿基缺失率互補鏈濃度差紫外吸收強度紫外分光光度計質(zhì)譜峰強度比化合物間濃度差紫外分光光度計脫磷酸化產(chǎn)物脫磷酸產(chǎn)物占比連接效率原料膠圖轉化率相對分子質(zhì)量凝膠電泳儀/36測定方法6.1總量檢測按照GB/T34797執(zhí)行。6.2相對分子質(zhì)量檢測6.2.1直接計算相對分子質(zhì)量可依據(jù)定制序列，按照式(1)直接計算：MW=(A×313.21)+(C×289.18)+(G×329.21)+(T×304.2)+79.98—61.94式中：MW——相對分子質(zhì)量；A,C,G,T-——各堿基相對應的堿基數(shù)；61.94———磷酸二酯鍵殘基相對分子質(zhì)量。6.2.2質(zhì)譜檢測采用LC-MS對磷酸化標記核酸的相對分子質(zhì)量(MW)進行檢測，LC-MS通過電噴霧電離源將樣品轉化為運動的帶電氣態(tài)離子碎片，然后按質(zhì)荷比(m/z)大小分離并記錄，通過質(zhì)譜分析軟件換算出目標化合物的相對分子質(zhì)量。儀器運行前檢查確認儀器的離子源、檢測器、數(shù)據(jù)系統(tǒng)等狀態(tài)正常，LC-MS的設備參數(shù)及流動相參數(shù)參考附錄B中的B.1。6.2.3測定結果采用6.2.2方法測得的相對分子質(zhì)量(MW)與6.2.1中計算的相對分子質(zhì)量(MW)進行比較得出相對誤差。6.3堿基準確度檢測磷酸化標記核酸序列和定制序列的匹配程度，由合成儀自動生成的序列信息與質(zhì)譜檢測、測序檢測的結果進行比對驗證。6.3.2液相色譜-質(zhì)譜法采用6.2.2方法測定，將測得的相對分子質(zhì)量與6.2.1中定制序列的理論相對分子質(zhì)量(MW)進行比對驗證。6.3.3基因測序法按照GB/T30989執(zhí)行，對磷酸化標記核酸進行序列測定。6.4純度檢測6.4.1紫外分光光度法按照GB/T30988執(zhí)行。4GB/T39512—2020采用HPLC儀對磷酸化標記核酸的純度進行測定，設備運行參數(shù)參考B.2。確保儀器狀態(tài)正常后，取10μL50μmol/L磷酸化標記核酸溶液和20μL超純水置于進樣瓶中混勻，點擊儀器運行按鈕，儀器自動進樣檢測。根據(jù)檢測結果計算目標峰面積占所有峰面積的比值，得出磷酸化標記核酸的純度。采用6.2.2方法測定，計算目標峰質(zhì)譜信號的強度占所有峰質(zhì)譜信號強度的比值，得出磷酸化標記核酸的質(zhì)譜純度。6.5堿基缺失率檢測采用6.2.2方法測定，計算缺堿基峰的質(zhì)譜信號強度占所有峰質(zhì)譜信號強度的比值，得出堿基缺失率。采用6.3.3方法測定，計算堿基缺失信號比例。6.6互補鏈濃度差檢測采用紫外分光光度法對磷酸化標記核酸進行紫外吸收強度檢測，測得核酸在260nm處的吸收強度即OD??o數(shù)值，測得的OD??o數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)作為最終定量的OD?6o數(shù)值，用OD?so數(shù)值除以消光系數(shù)轉換為樣品濃度。根據(jù)單鏈定量結果，計算兩條互補鏈間的濃度差。6.6.2質(zhì)譜峰強度比檢測采用6.2.2方法測定，計算雙鏈中含量較低的單鏈質(zhì)譜信號強度占雙鏈總質(zhì)譜信號強度的比值。6.6.3化合物間濃度差檢測采用紫外分光光度法對互補鏈退火后形成的磷酸化標記核酸雙鏈進行紫外吸收強度測定，將檢測的質(zhì)量濃度除以互補鏈混合產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量得出摩爾濃度，最終計算不同的磷酸化標記核酸雙鏈間的摩爾濃度差即化合物間濃度差。6.7脫磷酸化產(chǎn)物檢測采用6.2.2方法測定，計算未標記上磷酸基團的產(chǎn)物峰(其相對分子質(zhì)量比目標相對分子質(zhì)量低79.98)的質(zhì)譜信號強度占所有質(zhì)譜峰信號強度的比值，得出脫磷酸率。5GB/T39512—2020制的反應液置于20℃下反應4h,反應后取2μL反應液稀釋25倍后待用。物灰度值/(連接產(chǎn)物灰度值十剩余原料灰度值)。貯存于-20℃冰箱，避免反復凍融。未稀釋的干粉-20℃保存不宜超過1年；稀釋后的樣品-20℃不宜超過半年。8報告磷酸化標記核酸合成后應附合成報告單或等同的指導性文件。文件內(nèi)容應至少包括以下部分：h)保存條件和有效期。6GB/T39512—2020(資料性附錄)磷酸化標記核酸檢測指標項目及參考結果磷酸化標記核酸檢測的各指標項目和參考結果參見表A.1。表A.1磷酸化標記核酸檢測指標及參考結果樣品指標項目參考結果磷酸化標記核酸總量偏差≤±15%相對分子質(zhì)量偏差≤0.05%堿基準確度偏差≤0.05%與定制序列一致純度紫外吸收強度OD?bo/OD23o>1.7色譜純度質(zhì)譜純度堿基缺失率完全匹配度堿基缺失率互補鏈濃度差紫外吸收強度偏差<±15%質(zhì)譜峰強度比化合物間濃度差偏差≤25%脫磷酸化產(chǎn)物脫磷酸產(chǎn)物占比連接效率原料膠圖轉化率/相對分子質(zhì)量GB/T39512—2020(資料性附錄)a)液相色譜-質(zhì)譜法流動相配制參見表B.1;流動相A0.075%HFIPA0.0375%DIEA(以1L計算)流動相B(以1L計算)0.075%