ICS07.080A40中華人民共和國國家標準多肽抗菌性測定抑菌圈法2020-09-29發(fā)布2021-04-01實施國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會ⅠGB／T39101—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由全國生化檢測標準化技術委員會(SAC/TC387)提出并歸口。本標準起草單位：北京工商大學、河北科技大學、深圳市計量質量檢測研究院、河北農(nóng)業(yè)大學、北京薩姆伯科技有限公司、武漢明了生物科技有限公司、浙江東杰生物科技有限責任公司、市場監(jiān)督管理總局食品審評中心、中國測試技術研究院生物研究所。本標準主要起草人：賈英民、馬愛進、王志新、田益玲、郝帥、彭海、周李華、楊志堅、鄭燕燕、鄭剛、1GB／T39101—2020多肽抗菌性測定抑菌圈法本標準規(guī)定了多肽抗菌性的抑菌圈測定方法。本標準適用于多肽抗細菌性能和抗絲狀真菌性能的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1多肽介于氨基酸和蛋白質之間，由2個或2個以上氨基酸通過肽鍵連接形成的一類化合物。3.2抑菌圈固體培養(yǎng)基表面與試樣接觸邊界處無菌繁殖的環(huán)帶區(qū)域。3.3抗菌性抑制微生物繁殖的能力，以抑菌效價U值(AU)來表示。利用多肽在固體平板中與測試指示菌接觸后，使其周圍的菌株生長受到抑制，形成無菌繁殖區(qū)域，根據(jù)測試菌在固體平板表面表現(xiàn)出的抑菌圈直徑，計算抑菌效價U值來判定活性。5試劑或材料除非另有說明，本方法所用的試劑均為分析純，實驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。0.85%生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉于容量瓶中，用一級水溶解并定容至1000mL。121℃±1℃高壓蒸汽滅菌20min。2GB／T39101—2020營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),配制參見附錄A。5.3指示菌標準菌株藤黃微球菌蠟樣芽孢桿菌鼠傷寒沙門氏菌銅綠假單胞菌絲狀真菌黑曲霉產(chǎn)黃青霉桔青霉citrinum）CICC2478(ATCC9849)。6儀器設備電子天平感量為分光光度計波長范圍為6.4游標卡尺或抑菌圈測量儀：精度0.02mm~0.1mm。血球計數(shù)板格格或格格6.6玻璃平皿：直徑為90mm,底部平整。不銹鋼牛津杯內徑外徑高7試驗步驟7.1抗細菌性能測定稱取多肽樣品10.0mg,水溶性好的樣品采用無菌緩沖液溶解與定容，水溶性差的樣品先溶于無水乙醇再用無菌緩沖液定容至1.0mL,使其濃度為10.0mg/mL,作為儲備液，4℃~6℃冰箱中保存，應在一周內使用。使用時，采用無菌緩沖液將多肽儲備液進行稀釋，制備成至少5個不同濃度的待測溶將指示菌接種于培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)進行第一次傳代培養(yǎng)；取第一代培養(yǎng)液接種于5.0mLNB培養(yǎng)基的試管，36℃±1℃、200r/min±1r/min培養(yǎng)18h~24h進行第二次傳代培養(yǎng)；取第二代培養(yǎng)液接種于5.0mLNB培養(yǎng)基的試管或50.0mLNB培養(yǎng)基的錐形瓶，36℃±1℃、200r/min±1r/min培養(yǎng)至指示菌的穩(wěn)定期，作為第三代培養(yǎng)液。3GB／T39101—2020預先按照GB4789.2進行指示菌的菌落計數(shù)，建立菌落數(shù)與吸光度值(OD600)的對應關系；將第三代培養(yǎng)液調整至合適的吸光度值，使其菌懸液濃度為1×108CFU/mL~5×108CFU/mL。將配制的NA培養(yǎng)基加熱溶解，冷卻至45℃~50℃,將制備的指示菌菌懸液按照1%的添加量加入NA培養(yǎng)基中，充分混合均勻，量取20mL傾倒入滅菌平皿，輕輕搖動平皿使之均勻鋪平，待其凝固后備用。在含有指示菌的檢測平板中等距離安放5個~6個牛津杯，輕輕按壓，量取多肽樣品100μL,緩緩加入牛津杯中，每個處理重復3次。將平板移入4℃~6℃冰箱中預擴散4h~10h,取出平板，放入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)至抑菌圈清晰，采用游標卡尺或抑菌圈測量儀測定抑菌圈直徑，每個抑菌圈沿不同方向測量3次，并記錄平均值。以多肽稀釋倍數(shù)倒數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以抑菌圈直徑為縱坐標，建立線性方程（R2≥0.9900)。桿菌肽對S．a(chǎn)ureusATCC25923的線性關系圖參見附錄B的圖B.1。7.2抗絲狀真菌性能測定7.2.2指示菌孢子懸液制備將指示菌孢子或菌懸液接種于PDA培養(yǎng)基的固體平板上，29℃±1℃恒溫培養(yǎng)48h~72h,作為第一代孢子培養(yǎng)物；取第一代孢子培養(yǎng)物接種于PDA培養(yǎng)基的固體平板上，29℃±1℃恒溫培養(yǎng)48h~72h,作為第二代孢子培養(yǎng)物；取第二代孢子培養(yǎng)物接種于PDA培養(yǎng)基的固體平板上，29℃±1℃恒溫培養(yǎng)48h~72h,作為第三代孢子培養(yǎng)物。將第三代孢子培養(yǎng)物用0.85%生理鹽水洗脫孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子濃度調整至1×7.2.3檢測平板制備將配制的PDA培養(yǎng)基加熱溶解，冷卻至45℃~50℃,將制備的指示菌孢子懸液按照1%的添加量加入PDA培養(yǎng)基中，充分混合均勻，量取20mL傾倒入滅菌平皿，輕輕搖動平板使之均勻鋪平，待其凝固后備用。在含有指示菌的檢測平板中等距離安放5個~6個牛津杯，輕輕按壓，量取多肽樣品100μL,緩緩加入牛津杯中，每個處理重復3次。將平板移入4℃~6℃冰箱中預擴散4h~10h,取出平板，放入29℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)18h~24h至抑菌圈清晰，此時指示菌為菌苔狀，基本還未形成菌４GB／T39101—2020絲；采用游標卡尺或抑菌圈測量儀測定抑菌圈直徑，每個抑菌圈沿不同方向測量３次，并記錄平均值。以多肽稀釋倍數(shù)倒數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以抑菌圈直徑為縱坐標，建立線性方程（R２≥。硫酸多粘菌素Ｂ對A．的線性關系圖參見圖。8試驗數(shù)據(jù)處理抗菌性按式計算：式中：U—抗菌效價，單位為每毫克V—樣品的測定體積，單位為毫升X—線性方程的X軸截距；C—樣品的初始測定濃度，單位為毫克每毫升。計算結果以３次平行測定值的算術平均值表示，保留兩位有效數(shù)字。5GB／T39101—2020附錄A（資料性附錄）培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基7.4,分裝后于高壓蒸汽滅菌器中，121℃±1℃滅菌20min。A.1.2可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基，使用時嚴格遵照制造商的使用說明。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基值至分裝后于高壓蒸汽滅菌器中，滅菌A.2.2可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基，使用時嚴格遵照制造商的使用說明。馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基A.3.1將去皮切塊馬鈴薯200g放入1000mL一級水中，煮沸10min~20min,用紗布過濾，補加一級水至加入葡萄糖瓊脂加熱溶化調節(jié)值至滅菌20min。A.3.2可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基，使用時嚴格遵照制造商的使用說明。6GB／T39101—2020附錄B（資料性附錄）抗菌性測定線性關系圖B.1抗細菌性能測定桿菌肽二倍梯度稀釋5個濃度，濃度范圍為0.0625mg/mL