野生哺乳動(dòng)物遺傳多樣性監(jiān)測(cè)的DNA樣本采集技術(shù)規(guī)范1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了野生哺乳動(dòng)物遺傳多樣性監(jiān)測(cè)的DNA樣本采集的采集方法、采集工具及材料、采集種類(lèi)與數(shù)量、采集注意事項(xiàng)、存貯和運(yùn)輸注意事項(xiàng)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于野生哺乳動(dòng)物遺傳多樣性監(jiān)測(cè)的DNA樣本采集。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。HJ628-2011生物遺傳資源采集技術(shù)規(guī)范（試行）NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3采集方法3.1非損傷性取樣non-invasivesampling在不捕獲甚至不看到動(dòng)物的情況下，通過(guò)收集脫落的毛發(fā)、羽毛、糞便、食物殘?jiān)?、卵殼、蛹?xì)さ葮悠返娜臃椒?。本取樣方法的?yōu)點(diǎn)在于幾乎完全不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成影響且風(fēng)險(xiǎn)極小，缺點(diǎn)是本取樣方法獲得的樣本往往質(zhì)量不高，且樣本質(zhì)量會(huì)隨著時(shí)間推移持續(xù)下降，會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響。因此本取樣方法建議盡量在冬天使用，可以結(jié)合足跡鏈跟蹤、樣線(xiàn)法、大樣方法等技術(shù)方法進(jìn)行樣本采集3.2非傷害性取樣non-destructivesampling通過(guò)捕獲動(dòng)物來(lái)采集血液、毛發(fā)、羽毛、鱗片、腳趾等組織、不對(duì)其生理機(jī)能產(chǎn)生重大影響的取樣方法。本取樣方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以在獲得高質(zhì)量樣本的同時(shí)減小對(duì)動(dòng)物個(gè)體的傷害，缺點(diǎn)是使用本方法采樣時(shí)通常需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行捕捉、麻醉、放歸等環(huán)節(jié)，需要耗費(fèi)更多的人力物力、冒更大的風(fēng)險(xiǎn)，且可能對(duì)動(dòng)物種群造成一定的影響如導(dǎo)致其對(duì)人的攻擊性增強(qiáng)等。因此本取樣方法僅建議對(duì)遠(yuǎn)離種群中心群體的游離個(gè)體進(jìn)行使用，且在使用過(guò)程中一定要保證相關(guān)人員的人身安全。3.3傷害性取樣destructivesampling通過(guò)嚴(yán)重傷害甚至殺死動(dòng)物而獲得新鮮肌肉、器官等組織樣品的取樣方法。本取樣方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以得到較高質(zhì)量的樣本，缺點(diǎn)是會(huì)殺死動(dòng)物或?qū)?dòng)物的生理機(jī)能造成極大傷害，被取樣動(dòng)物基本無(wú)法存活。因此本取樣方法僅建議在年齡較大、身體較虛弱或基本已經(jīng)喪失繁殖能力的個(gè)體上使用以避免對(duì)野生動(dòng)物種群造成過(guò)大的傷害。4采集工具及材料4.1捕捉工具捕捉工具包括：捕捉網(wǎng)、自制陷阱和麻醉槍?zhuān)ㄡ槪┑龋瑧?yīng)根據(jù)采集對(duì)象進(jìn)行選擇。麻醉藥物可使用復(fù)合麻醉劑靜松痛（氯胺酮與隆朋1:1復(fù)合劑），麻醉藥解藥可以使用育亨賓和“705”以1:1配比的復(fù)合劑，用藥劑量應(yīng)根據(jù)動(dòng)物物種與體重的不同通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行調(diào)整。4.2處理器材處理器材包括：剪刀（醫(yī)用級(jí)或科學(xué)級(jí)）、解剖刀、鑷子、帶帽塑料試管（或離心管）、帶帽廣口瓶、滴管、封口塑料袋、錫箔盒、乳膠手套、手搖離心機(jī)等。器材應(yīng)事先洗凈并消毒，避免樣本污染和傳染疾病。4.3記錄工具記錄工具包括：記號(hào)筆、標(biāo)簽紙、鉛筆等。4.4處理和貯存材料處理和貯存材料包括：蒸餾水、液氮、干冰、冰盒、冰袋、90%-100%乙醇、DNA緩沖液、血液抗凝劑等。5采集種類(lèi)與數(shù)量5.1動(dòng)物組織哺乳動(dòng)物組織樣本一般采集動(dòng)物的耳緣組織或趾，依據(jù)動(dòng)物種類(lèi)及大小進(jìn)行選擇，通常重量達(dá)到200mg即可滿(mǎn)足檢測(cè)檢驗(yàn)要求。5.2動(dòng)物血液哺乳動(dòng)物最常見(jiàn)的采血部位包括頸靜脈、大隱靜脈、頭靜脈和股靜脈?；铙w動(dòng)物血液采集量應(yīng)小于其體重的1%，以防止對(duì)其生長(zhǎng)、繁殖、活動(dòng)產(chǎn)生影響，通常50ul即可滿(mǎn)足監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)需求。5.3動(dòng)物糞便動(dòng)物糞便是動(dòng)物的大腸排遺物，由于從糞便中遺傳信息對(duì)動(dòng)物本身無(wú)影響，在采集時(shí)應(yīng)采集整體糞球各部位足量新鮮的為宜。5.4動(dòng)物毛發(fā)由于從脫落的毛發(fā)中可提取遺傳信息且采集樣本對(duì)動(dòng)物本身無(wú)影響，在采集時(shí)應(yīng)盡量盡可能多的采集。6采集注意事項(xiàng)6.1動(dòng)物組織采集注意事項(xiàng)對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行采樣時(shí)，在麻醉后使用適當(dāng)?shù)募s束裝置，以保護(hù)動(dòng)物和處理者，防止動(dòng)物突然蘇醒或在神志不清是對(duì)操作人員進(jìn)行攻擊。采集的組織用蒸餾水清洗晾干后放入含有能夠沒(méi)過(guò)它的95%乙醇溶液或DNA緩沖液的離心管中保存（固液體積比通常為1:10），以防止遺傳物質(zhì)自然降解。6.2動(dòng)物血液采集注意事項(xiàng)采血前應(yīng)用蒸餾水或酒精清潔采血部位。采集后血液可置于加入了血液抗凝劑的帶帽試管或離心管中，防止血液凝固影響下一步實(shí)驗(yàn)。6.3動(dòng)物糞便采集注意事項(xiàng)（1）冬季采集時(shí)要將整塊糞便裝入封口袋（帶一次性手套或套取樣袋抓取），注意在采集過(guò)程中盡量不要對(duì)糞便表面粘膜產(chǎn)生破壞，避免將遺傳物質(zhì)破壞。（2）非冬季采集時(shí)依據(jù)物種不同將糞便尾部切下或逐粒裝入裝有變色硅膠顆粒的離心管或封口塑料袋中密封，其余部分用信封保存，以避免濕潤(rùn)環(huán)境下微生物生長(zhǎng)破壞遺傳物質(zhì)。（3）每次采集時(shí)都使用新的一次性手套，防止樣本污染。6.4動(dòng)物毛發(fā)采集注意事項(xiàng)毛發(fā)樣本可在用蒸餾水沖去表面臟物后直接放入離心管或封口塑料袋中保存，避免細(xì)小樣本遺失。6.5樣本采集中防疫注意事項(xiàng)進(jìn)入感染或可能感染和無(wú)害化處理地點(diǎn)，應(yīng)穿防護(hù)服、戴橡膠手套、口罩、護(hù)目鏡、穿膠鞋，防止疫病感染。離開(kāi)感染或可能感染和無(wú)害化處理地點(diǎn)，應(yīng)做如下處理：（1）應(yīng)先脫去個(gè)人防護(hù)裝備再脫手套；（2）脫個(gè)人防護(hù)設(shè)備時(shí)，污染物要裝入熟料帶內(nèi)，置于指定地點(diǎn)；（3）將脫掉的防護(hù)裝備置于容器內(nèi)進(jìn)行消毒。6.6健康監(jiān)測(cè)對(duì)所有擁有感染風(fēng)險(xiǎn)的人員按照DB11/T456-2007中6的規(guī)定進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)，防止疫病傳播。6.7樣本標(biāo)記記錄注意事項(xiàng)（1）采集的遺傳資源樣本應(yīng)做好報(bào)備，應(yīng)符合HJ628-2011中15.1的規(guī)定。（2）樣本采集記錄的事項(xiàng)應(yīng)該包括且不限于：采集人的基本信息（姓名、身份證號(hào)、所屬機(jī)構(gòu)、地址、聯(lián)系方式）、審批部門(mén)和審批文號(hào)、采集目的、采集時(shí)間、采集地點(diǎn)信息（地理位置、植被類(lèi)型、棲息地情況、經(jīng)緯度坐標(biāo)、海拔高度、溫度、濕度、照片等）、樣本編號(hào)、采集樣本的基本信息（中文名、學(xué)名、樣本種類(lèi)、采集數(shù)量等）。7存貯和運(yùn)輸注意事項(xiàng)（1）應(yīng)以最快最直接的途徑將所采集的樣本送往實(shí)驗(yàn)室。（2）對(duì)于可在采集后24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的樣本可以在4℃左右的容器中冷藏運(yùn)輸（可使用冰盒、冰袋