1《內分泌干擾物檢測轉基因斑馬魚法》編制說明斑馬魚作為一種小型脊椎類模式生物，在全球范圍內已有90多年的研究歷史，在藥品、保健食品及食品等領域的應用已得到大量相關領域企業(yè)的認可。斑馬魚試驗既有體外試驗快速、高效的特點，又具備哺乳動物試驗相關性好、預測性高的特點，并且符合國際動物福利保護趨勢，當下已經取得了顯著的科研和在此背景下，環(huán)特生物向中國乳制品工業(yè)協會提交請。中國乳制品工業(yè)協會組織專家召開的標準立項審核論證會通過了該團標的立項申請，并確定由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司牽頭承擔標準起草任務。該項標準旨在建立類雌激素物質檢測的新標準，彌補現有檢測方法在檢測敏感性和操作便捷性方面的司、樸誠乳業(yè)（集團）有限公司、云南云科特色國家食品安全風險評估中心、內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）測技術研究所、寧波海關技術中心、君樂寶乳業(yè)集團、南京歆佳醫(yī)藥科技有限公起草人名單：徐懿喬、朱曉宇、曹兵兵、解慶剛、毛新亮、高業(yè)成、張迎春、王飛飛、代榮波、賈旭東、劉姍、梁晶晶、趙超群、逯剛、董立雅、邱靜、劉漢偉、黃亞芳、周佳麗標準制訂工作的組織、方法開發(fā)、方法驗證和標準文本提供方法驗證的樣品、提供相關樣品的標準方法測試數據、標準內容審核與修訂：浙江省食品藥品檢驗研究院、國家食品安全風險評估中心、寧波海關技術中心、南京歆佳醫(yī)藥科技有限公標準內容審核與修訂：黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、完美（廣東）有限公司、云南云科特色植物提取實驗室有限公司、內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司、中國農環(huán)境雌激素（EnvironmentalEstrogens化功能的化學物質，三大主要的EEs有1、生物來源雌激素，2、人工合成雌激素，3、環(huán)制品中天然存在內源性雌激素，主要包括雌酮、β-雌二醇、雌三醇，其中β-雌二醇的活性最強，在正2況下含量很低，并不會擾亂人體的生理機能和激素代謝；另外還可能有人為添加的，屬于人工合成性雌激素，最具代表性的是二苯乙烯類合成雌激素，主要有己烯雌酚，己二烯雌酚，己烷雌酚等，以進入動物體內，通過干擾動物體內源性雌激素的合成、分泌、轉運、結合、活性反應、代謝、消生類似生物體內源性雌激素的作用。而己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚都屬于人工合成的雌性激素，是用。多種可促進動物生長的代用物的效力都遠不如己烯雌酚，以致使己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌是己烯雌酚等人工合成的雌性激素在動物生產過程中的使用禁而不止。現已證實這些人工合成的雌可在動物的肝臟、肌肉中殘留。如果人們長期食用這種激素含量較高的動物產品，會導致產生諸如可檢測有雌激素活性的物質的存在方法很多。理化檢測通常檢測的是結構已知的物質，但雌激繁多，結構差異大，化學結構與生物活性的相關性難以預測。生物學檢測可以很好模擬人病理吸收代斑馬魚（Zebrafish）具有個體小、繁殖率高、生長周期短、胚胎透明、與人類基因的同源性高、易于進行轉基因操作并得到基因突變體，成為研究脊椎動物環(huán)境毒理學的理想模式生物。斑馬魚已被歐美和中國監(jiān)管部門廣泛認可，歐洲經濟與合作發(fā)展組織（OECD）已經頒布了10余項斑馬魚環(huán)境毒理學評價指南。OECD和日本的生殖毒理學家采用斑馬魚作為檢測水環(huán)境內分泌干擾物濃度的早期敏感對中有三個基因與哺乳動物雌激素受體（ERs）同源：erα（在斑馬魚中也稱為或esr2a）和erβ2（nr3a2b或esr2b）。三種雌激素受體均可與雌激素響應元件（ERE）本標準應用轉基因雌激素斑馬魚，建立類雌激素生物學檢測新方法，彌補現有檢測方法在檢測敏和操作便捷性方面的不足，達到快速、高效、低成本的篩查品中潛在風險物質的目的，是對現行理化檢測在前期工作的基礎上，進一步開展了立項前的行業(yè)調研工作、召開了溝通會議，廣泛聽取行業(yè)意見和建議。杭州環(huán)特生物科技股份有限公司向中國乳制品在與行業(yè)專家和相關企業(yè)充分溝通的基礎上，2022年07月21日召開了標準立項審評會，提案單位進行了立項答辯。標準立項通過專家審核并在中國乳制品工業(yè)協會官網發(fā)布立項公告。隨后成立了標準工作組。工作組由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司、黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、完美（廣東）日用品有限公司、樸誠乳業(yè)（集團）有限公司、云南云科特色植物提取實驗室有限公司、浙江省食品藥品檢驗研究院、3國家食品安全風險評估中心、內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司、中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所、寧波海關技術中心、君樂寶乳業(yè)集團、南京歆佳醫(yī)藥科技有限公司的多位專家組成，正式杭州環(huán)特生物科技股份有限公司等12家單位對加標奶粉的化學提取方法驗證，斑馬魚對內分泌干擾物各標準制定參與單位對標準草稿進行了充分討論，同時也多次向行業(yè)專家征求意見。標準編制小組在聽取專家建議和意見的基礎上，對標準草稿做了進一步的修改和完善，形成本標準征求意見稿。在雌激素作用下，雌激素受體（Estrogenreceptor，ER）ERs的基因在肝臟中的表達會明顯上調。因此，ERs的基因可以作為生物體內雌激素活性檢測的典型生物標志物。本方法中使用的雌激素斑馬魚構建是以UAS-GFF基因表達調控系統(tǒng)為基礎，利用優(yōu)化重組的雌激素響應元件（ERE）驅動達，進而對下游UAS質粒中熒光基因eGFP表達進行調控。類雌激素物質能刺激5×ERE響應，激活GFF的表達，而GFF蛋白可與UAS結合，進而驅動綠色熒光蛋白（EGFP）的表達，從而達到方便、直觀、動態(tài)檢測Tg（5xERE:GFF;UAS:EGFP）根據國內外斑馬魚相關試驗的指南和標準，推薦將斑馬魚幼魚的孵育水溫控制在26-28.5℃。溫度偏離這個范圍的話，斑馬魚的發(fā)育會出現明顯的延遲或加快，需要相應地調整試驗方在收集親魚新繁殖的胚胎時，需要用標準稀釋水將胚胎清洗3遍左右，將胚胎卵膜上可能粘連的食物殘渣、糞便清洗干凈，盡量減少食物殘渣和糞便中攜帶的微生物特別是真菌對胚胎發(fā)育和生長的影響。除了在收集胚胎時會發(fā)現部分死亡胚胎之外，有部分胚胎會因為存在自身的缺陷而在發(fā)育過程中死亡。因為4斑馬魚孵育的溫度較高，所以死亡的胚胎很容易腐爛變質，如果清理不及時，就會導致水質惡化，同時影響其它胚胎的發(fā)育。根據斑馬魚的胚胎發(fā)育階段特點，大部分先天因素導致的胚胎死亡發(fā)生在受精后6小時以內，因此，在胚胎受精后6小時左右或當天下班前進行清理；在胚胎受精后24小時再清理一次死胚在胚胎發(fā)育的過程中，隨著胚胎植物極營養(yǎng)物質的消耗，會產生大量的代謝產物，這些代謝產物如果在水體中積累過多，也會導致水質惡化。因此，至少應該每天更換一次胚胎養(yǎng)殖水，每次更換不少于2/3的斑馬魚胚胎和幼魚的孵育可以根據實際情況選擇不同的容器，比如培養(yǎng)皿、廣口罐、細胞培養(yǎng)板、燒杯等。在選擇容器時，建議選擇用惰性材料制成的容器。孵育時要注意培養(yǎng)皿中的斑馬魚胚胎和幼魚的密度，通常建議每尾斑馬魚最少100μL液體，液體過少會導致斑馬魚生長空間不足，影響發(fā)育。對于斑馬魚幼魚培養(yǎng)密度，建議6孔培養(yǎng)板每個孔不超過30尾，12孔培養(yǎng)板每個孔不超過20尾，24孔培養(yǎng)板每個孔不超過10尾，10cm培養(yǎng)皿不超過150尾；對于廣口罐和燒杯等大體積容器，建議斑馬魚胚胎和幼魚的數量控成魚的抵抗力和適應能力強，因此對水質的要求不是很嚴格，可用去離子水加入適量的人工海鹽和碳酸氫鈉（NaHCO3），使水體的重要參數保持在斑馬魚的適宜范圍內即可（電導率維持在480~510胚胎和幼魚對水質的要求比成魚嚴格，此外，為了減少水質波動對試驗結果的影響，培養(yǎng)液的成分應盡量清晰。因此，胚胎和幼魚的孵育建議使用標準稀釋水（40×標準稀釋水配制方法：NaHCO3：2.52（1）樣品的前處理。首先，考慮到斑馬魚實驗體系對馬魚適宜生長的溫度28.5℃容易引起水質污染，造成斑馬魚缺氧死亡。其次，內分泌干擾物的生物效應與濃度呈正相關，一些樣品中內分泌干擾物相對濃度較低，需要增加樣品中類雌激素的濃度。因此，建議樣品通過化學提取進行前處理。具體方法如下：1）取10g樣品置于50mL離心管中，共4管；2）分別向每個離心管中加入15mL超純水，渦旋1min，混勻水浴鍋預熱至35~40℃)超聲5min，之后分別在每個離心管中加入22.5mL乙腈，渦旋1min，混勻，超聲5min；3）分別向每個離心管中加入6.0g氯化鈉，渦旋1min,混勻1000rpm，離心10min，將離心完的上清液裝入離心管中；4）將含有上清液的離心管，放置到氮吹儀中，氮吹至干燥，加入4mL甲醇復溶，隨后將液體移入裝有300mgC18的5mL離心管，渦旋30s，于4000rpm，離心1min，取凈化過的上清液過0.22μm濾膜，進行過濾，收集液體。（2）助溶劑的使用。食品的成分較為復雜，既含有水溶性成分，也含有脂溶性成分，還有一些不溶性成分（如超微粉碎后直接使用的原料粉、益生菌等）。為了讓食品中的有效成分盡量溶解或均勻分散，有時候不得不使用一些助溶劑，包括有機溶劑和分散劑。本標準推薦使用的都是相關標準中推薦或者有相5關科研文獻證明其對斑馬魚安全性的助溶劑。推薦的溶劑：丙酮、乙醇、甲醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、三甘醇。推薦的分散劑：聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐溫80、0.01%的纖維素甲醚、聚氧乙烯化氫化對于助溶劑的使用限量，根據長期積累的數據以及本標準涉及到試驗內容的特點，本標準將助溶劑的濃度上限定為1%（W/V或V/V）。1%的濃度上限并不意味著所有助溶劑的終濃度都可以用到1%（例如乙醇不應超過0.5%）。在試驗溶液配制不受影響的情況下，助溶劑的使用量通常不應超過0.1%。只有當樣品溶解性確實不好且助溶劑安全性非常好的的情況下，方可將助溶劑的終濃度最高增加到1%。如果樣品配制（3）試驗溶液的pH。斑馬魚最適的pH是在6.8-7.5之間，pH6.0-8.5可以正常生長，短期內pH5.0-9.0也可以耐受。一旦pH值<5.0或者>9.0，即便是短期內也會對斑馬魚產生嚴重傷害。因此，在試驗中要盡量使試驗溶液的pH值維持在最適宜斑馬魚生長的范圍內。如果加入樣品后試驗溶液的pH值有明顯變化，不應該直接調節(jié)試驗溶液的pH，因為會改變整個試驗體系；應該調節(jié)樣品貯備液的pH值，使其接近加入樣品為了避免在調節(jié)pH的時候引入其它可能影響試驗結果的化學物質，推薦使用HCl和NaOH來調節(jié)。為了避免因為調節(jié)pH導致貯備液的成分和濃度發(fā)生變化，在調節(jié)pH的過程中，貯備液的顏色不應發(fā)生變（4）在本標準的試驗方法中，斑馬魚是直接暴露在樣品溶液中，為了減少滲透壓過高對斑馬魚正常生理活動的影響，對樣品的測試濃度要設置一定的上限。根據經驗，對于以小分子單體化合物為主要成分的樣品（如維生素、礦物質），測試濃度上限定為1000μg/mL；對于成分多樣混合物（如天然植物提取物）或分子量＜3KD的大分子化合物的測試濃度上限為2000效成分含量或者可溶性成分濃度來確定測試上限，通常用體積比表示。對于很難溶解或很難均勻分散的樣品物質，水溶暴露后很難保證斑馬魚的有效吸收，應考慮對樣品必要的前處理或改用水溶暴露以外的其它處理方式。根據OECD236指南的內容，對于分子量≥3KD的大分子化合物，因為生物利用度的限制，不適合采用水溶暴露方式，應考慮對樣品必要的前處理（5）在日常的試驗過程中，發(fā)現有一些單體成分或者天然提取物自身會產生熒光信號。如果樣品產生熒光的條件（激發(fā)波長和發(fā)射波長）與內分泌干擾物誘發(fā)的綠色熒光相同，就會對試驗結果產生一定的（6）每次試驗前需要測試一次樣品溶液的溶解氧和pH，以確保樣品溶液的溶解氧和pH在正常的范圍內，避免水體環(huán)境對試驗結果的干擾。在本標準規(guī)定的評價方法下，換液時進行一次測試即可，試驗終點選擇的是早期發(fā)育過程中的斑馬魚，這個階段斑馬魚發(fā)育較快，受精后不同天數的斑馬魚生理狀態(tài)會6有很大的差別。因此，斑馬魚發(fā)育階段的選擇就非受精后3天的斑馬魚肝臟開始發(fā)育，受精后5天肝臟發(fā)育完全。當Tg（5xERE:GFF;UAS:EGFP）品系接觸到內分泌干擾物，綠色熒光在肝臟表達，因此，發(fā)育階段必須選擇受精后3天及以后。通過大量試驗發(fā)現，斑馬魚暴露在內分泌干擾物中24小時后（即給藥），為了避免因斑馬魚個體異常或死亡導致試驗數據不滿足統(tǒng)計學要求的情況發(fā)生，在造模和樣段，每組的斑馬魚數量應不少于20尾，除特殊情對于一些已經有其它試驗數據的樣品，可以從兩個維度來確定斑馬魚預試驗的濃度設計1）根據已有的其它試驗數據推算而來斑馬魚試驗濃度2）樣品自身特性所決定的測試上限。當推算得出的試驗濃度超出本標準所規(guī)定該類別樣品的測試上限或樣品自身的溶解度上限時，以測試上限或溶解度上限為預試驗的最高濃度，然后向下設計一系列濃度，其中需要包含推算得出的試驗濃度；當推算得出的試驗濃度不高于本標準所規(guī)定該類別樣品的測試上限和樣品自身的溶解度上限時，可以將推算得出的試驗濃度作對于沒有其它試驗數據的樣品，直接根據樣品自身特性所決定的測試上限（本標準所規(guī)定該類別樣品根據經驗，預試驗的樣品試驗濃度范圍跨度不應小于10，濃度范圍跨度過小，可能無法通過預試驗確定樣品的無可觀察毒性效應濃度（NOEC）；同時，濃度的間隔系數不大于3.2，濃度的間隔系數過大，可能導致試驗確定的NOEC值遠小于真實的最高安全濃度，導致后續(xù)正式試驗的測試濃度偏低，可能影響試驗結果的準確性。正式試驗的樣品濃度的間隔系數同樣不能大于3.2，樣品的濃度組別數可以根據需要設置，一般不應少于3組。濃度間隔系數過大或者濃度組別過少，可能都會導致試驗結果的偏差，無法充分隨機選取至少10尾斑馬魚用甲基纖維素固定在體視（熒光）顯微鏡下觀察拍照，拍照部位為從斑馬魚頭部至卵黃囊，通常需要采集完整的全身明場圖片用于制作示意圖。拍照時斑馬魚應頭朝左、腹部朝下、照片的拍攝效果主要取決于顯微鏡的放大倍數和光源條件等，要求背景干擾小、圖像清晰、定量區(qū)域肝臟完全落在視野范圍之內。實際工作中，可以根據實驗室顯微鏡的配置情況適當調整拍照參數，但同一次試驗應當在相同的條件下進行拍照，通常要求體視顯微鏡的放大倍數不低于20倍，拍照系統(tǒng)的像素不低7拍照完成后，可以使用熒光顯微鏡廠家配備的圖像分析軟件或者其它的專業(yè)圖像分析軟件進行分析。在分析時，將斑馬魚肝臟設置為感興趣區(qū)域（ROI，regionofinter它類似指標）。有些圖像分析軟件可以直接計算ROI的光密度總和，有些圖像分析軟件只能通過分別計算ROI總面積和光密度平均值來計算得到ROI的光密度總和（ROI光密度=ROI面積×ROI光密度平均值）。用分析得到的ROI熒光總和值來表示斑馬魚肝臟類雌激素物質的含量。將圖像分析得到的數值進行統(tǒng)計學分析，計算各組試驗的平均值（Mean）及標準誤差（StandardError，SE），統(tǒng)計學處理結果用Mean±SE表示。與平均值相差2個SD以上的數據可以按照異常數據予以剔除，每組數據最多只能剔除2個異常數據。剔除掉異常數據之后，采用統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。宜采用方差分析，按方差分析的程序先進行正態(tài)性檢驗（P值）和方差齊性檢驗（F值）。當F<0.05，P<0.05時，各組均數間組間至少有一組有顯著性差異，宜采用非參數檢驗。當F≥0.05，P≥0.05時，采用單因素方差分析，選擇事后兩兩比較的結果進行統(tǒng)計。對非正態(tài)或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統(tǒng)計。若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊性的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。樣品處理組與溶劑對照組相比較，P<0.05表明統(tǒng)計學上有顯著性差異。受試樣品各濃度組與溶劑對照組比較，任一濃度組肝臟熒光強度總和升高，差異有顯著性，可判定該根據前期積累的大量試驗數據，當且僅當一個試驗滿足如下的質量控制要求時，試驗結果的有效性才（1）正常對照組（如果使用了助溶劑，也包括溶劑對照組）斑馬魚的死亡率或異常率不得超過（2）正式試驗中，如果使用了助溶劑，溶劑對照組與正常對照組之間不能存在統(tǒng)計學上的顯著性差異，如果溶劑對照組與正常對照組之間存在統(tǒng)計（3）正式試驗中，陽性對照組與正常對照組之間存在統(tǒng)計學上的顯著性差異，否則該次試驗結果視8乙腈中8種甾體激素混標溶液（GB31658.9-2021&農業(yè)農村部公告第282號-1-2020）和乙腈中8種甾體激素內標混標溶液（GB31658.9-2021內標&農業(yè)農村部公告第282號-1-2020）具體信息Z,Z-雙烯雌酚-D6條件參考《GB31658.9-2021食品安全國家標98種內分泌干擾加標回收結果顯示平均回收率在87.730~106.275%，在標準文本確定后，本標準提出單位與各參與單位協商，確定了共計4種內分泌干擾物陽性化合物和2種內分泌干擾物陰性化合物，這些化合物是否具有內分泌干擾物效應均有文獻報道，用于對本標準所述試123456除本標準提出單位杭州環(huán)特生物科技股份有限公司之外，另有兩家從標準試驗方法的驗證工作。驗證單位和人員的詳細信息本標準規(guī)定的試驗方法的測試結果受多種因素的影響，如樣品處理方式、斑馬魚胚胎的質量狀況、拍照技術、定量方法等。因此，為了驗證方法的一致性，我們組織了協同驗證試驗，由三家具有斑馬魚試驗能力的實驗室單位，在相同的試驗條件下對同一樣品標準提出單位杭州環(huán)特生物科技股份有限公司、驗證單位1寧波海關技術中心、驗證單位2南京歆佳醫(yī)藥科技股份有限公司分別按照本標準文本中的方法對表1中所列的全部6種樣品進行內分泌干擾物效應評價。3家驗證單位的試驗結果表明，上述4種內分泌干擾物陽性化合物（雌二醇、4-叔辛基苯酚、雙酚A和炔雌醇）在斑馬魚評價試驗中均呈陽性反應，2種內分泌干擾物陰性化合物（11-酮睪酮和地塞米松）均三家驗證單位用同樣的方法測試同一個樣品，結果顯示不同實驗室之間斑馬魚內分泌干擾物陽性化合物和陰性化合物含量非常接近，測試結果的相對標準偏差達到20%以內，說明不同實驗室之間的重復性較本標準制定過程中查到同類國際標準：OECDTG250EASZYassay:DetectionofEndocrineActiveSubstances,actingthroughestrogenreceptors,usingtransgenictg(cyp19a1b:GFP)Zebraf在的危害。世界衛(wèi)生組織和國際化學品安全規(guī)劃(WHO/IPCS)將內分泌干擾物定義為能改變內分泌功能并對生物體或子代造成不良影響的外源物質。2021年我國明確將內分污染物。本標準的實施有利于政府監(jiān)管部門管控內分泌干擾物的使用，規(guī)范市場競爭，打擊非法添加生產行為，倒逼企業(yè)進一步提高生產質量水平，壓縮違法生產企業(yè)市場生存空間，維護健康的市場秩序，為人民食品安全保駕護航。減少內分泌干擾物的攝入將減少免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經系統(tǒng)的疾病發(fā)生、發(fā)[1]孫沛雯,王中衛(wèi),李翔宇,等.不同水體中環(huán)境類雌激素污染狀況調查與分析[J].干旱環(huán)境監(jiān)測,[2]DuB,FanG,YuW,etal.OccurrenceandriskassessmentofAfive-yearworldwideperspective[J].EnvironPollut,2020,267:115405.[3]AdeelM,SongX,WangY,etal.Environmentalimpactofestrogensonhuman,animalandplantlife:Acriticalreview[J].EnvironInt,2017,99:107-119.YilmazB,TerekeciH,SandalS,etal.Endocrinedisruptingchemicals:exposure,effectsonhumanhealth,mechanismofaction,modelsfortestingandstrategiesforprevention[J].RevEndocrMetabDisord,2020,21(1):127-147.[4]羅書.全自動固相萃取-高效液相色譜法測定養(yǎng)殖場廢水中6種常見環(huán)境雌激素的殘留量[J].理化檢驗-化[5]劉小紅,鄧華,常林,等.環(huán)境雌激