3.2基因工程的基本操作程序【補充】基因的結(jié)構(gòu)DNA片段基因1基因2基因3放大基因通常是有遺傳效應的DNA片段能編碼特定的蛋白質(zhì)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能轉(zhuǎn)錄出mRNA，進一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)。不轉(zhuǎn)錄、不翻譯不轉(zhuǎn)錄、不翻譯非編碼區(qū)：含有能調(diào)控遺傳信息表達的DNA序列，如啟動子、終止子啟動子終止子獲取目的基因一般獲取哪一部分的DNA片段？基因編碼區(qū)獲取了足夠量的Bt基因后，下一步就是要讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時，使Bt基因能夠表達和發(fā)揮作用這就是需要構(gòu)建基因表達載體。這也是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的核心工作1.構(gòu)建基因表達載體的目的：2.基因表達載體的組成思考：要各個部分有什么作用？（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細胞中表達和發(fā)揮作用。（核心步驟）02目的基因：能控制表達所需要的特殊性狀必須插到啟動子和終止子之間復制原點：DNA復制的起始位點終止子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄四環(huán)素抗性基因、熒光蛋白基因等啟動子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA標記基因：鑒別或篩選含有重組DNA分子的受體細胞（如：已成功轉(zhuǎn)化的受體細胞具有某種抗性基因，可在相應選擇培養(yǎng)基中生長）02基因表達載體的構(gòu)建

當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達。誘導型啟動子：普通的細菌一般是對抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四環(huán)素的培養(yǎng)基中______（能/不能）生長。如果給普通細菌導入一個含有四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒，四環(huán)素抗性基因的____________可使細菌獲得抵抗四環(huán)素的性狀。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞。敏感不能表達產(chǎn)物【思考】如何利用標記基因篩選呢？啟動子終止子起始密碼子終止密碼子【區(qū)分兩組概念】位于DNA上位于mRNA上啟動翻譯終止翻譯啟動轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄(本身不轉(zhuǎn)錄)決定氨基酸不決定氨基酸對比啟動子起始密碼子終止子終止密碼子所在位置DNAmRNADNAmRNA作用RNA聚合酶的結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄的起始點。翻譯的起始點AUG(甲硫氨酸）GUG（纈氨酸）轉(zhuǎn)錄的終點翻譯的終點（UAA、UGA、UAG)02基因表達載體的構(gòu)建重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因DNA連接酶基因表達載體構(gòu)建模式圖限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復制原點質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？基因表達載體3.構(gòu)建基因表達載體的過程限制酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因限制酶重組DNA分子DNA連接酶啟動子終止子質(zhì)粒限制酶切割位點①用限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個切口；②用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，獲取目的基因；③用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體缺口處，形成重組DNA分子。目的基因與質(zhì)粒載體缺口的末端相同，便于連接（重組質(zhì)粒）3.構(gòu)建基因表達載體的過程基因表達載體基因表達載體的構(gòu)建（核心步驟）02基因表達載體重組DNA分子目的基因DNA限制酶限制酶DNA連接酶載體②能自我復制,或整合到受體DNA上隨受體DNA同步復制①有一個至多個限制酶切割位點③具有標記基因

④對受體細胞無毒載體應具備條件：限制酶切割位點標記基因復制原點載體的種類：質(zhì)粒（常用）、噬菌體、動植物病毒目的基因DNA限制酶切割位點標記基因復制原點質(zhì)粒載體與基因表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段?；虮磉_載體在載體基礎上增加了目的基因?！締栴}探究】請結(jié)合下圖，回答問題：（1）構(gòu)建基因表達載體時，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因為SmaⅠ切割會破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進一步篩選。（2）只使用EcoRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達載體？能會出現(xiàn)以下產(chǎn)物：①目的基因——載體連接物②載體——載體連接物③目的基因——目的基因連接物②③分別叫做載體的自身環(huán)化和目的基因的自身環(huán)化×活動一：用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，用DNA連接酶連接后會出現(xiàn)幾種產(chǎn)物(只考慮兩兩結(jié)合)？

單酶切只用一種限制酶切割的時候可能會出現(xiàn)什么問題？質(zhì)粒與目的基因反向連接單酶切缺點:質(zhì)粒重新環(huán)化目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒與目的基因反向連接02基因表達載體的構(gòu)建（3）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點是什么？①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。所以如何防止目的基因和載體的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？雙酶切（產(chǎn)生不同的黏性末端）用兩種不同的限制酶同時對目的基因和載體進行切割【問題探究】請結(jié)合下圖，回答問題：雙酶切用兩種不同的限制酶同時對目的基因和載體進行切割【實戰(zhàn)】圖解限制酶的選擇原則（1）不破壞目的基因：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ。（2）保留標記基因（至少保留1個完整的標記基因）、啟動子、終止子、復制原點：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。（3）確保載體和目的基因出現(xiàn)相同黏性末端：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；（4）為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和目的基因反向連接到載體，可選用什么限制酶？可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒。1.轉(zhuǎn)化指目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程，此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。2.將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法03將目的基因?qū)胧荏w細胞冠癭瘤農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，并誘導產(chǎn)生冠癭瘤等。（1）將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②農(nóng)桿菌特點：a.能在自然條件下侵染_____________和___________，而對大多數(shù)____________沒有侵染能力。雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有______，當它侵染植物細胞后，能將___

___上的____

__（____________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其________________________Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細胞的染色體DNA上將目的基因插入__________________中，通過農(nóng)桿菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達。③利用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進入植物細胞（1）將目的基因?qū)胫参锛毎?-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。載體：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（T-DNA)03閱讀P81資料卡，完成以下填空：T-DNA目的基因構(gòu)建表達載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導入植物細胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細胞將目的基因插入染色體DNA中？植物組織培養(yǎng)非人工操作非人工操作（1）將目的基因?qū)胫参锛毎?-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程雙子葉、裸子植物受損傷口分泌酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)吸引農(nóng)桿菌向受傷組織集中將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞中，并且將其整合到該細胞染色體DNA上。激活Vir區(qū)基因，導致T-DNA加工和轉(zhuǎn)移（1）將目的基因?qū)胫参锛毎?-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程(1)第一次拼接______________________________________________________________________(2)第二次拼接______________________________________________________________________(3)第一次導入_____________________________________________________________________(4)第二次導入____________________________________________________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導入農(nóng)桿菌含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）03將目的基因?qū)胧荏w細胞據(jù)圖回答問題：03將目的基因?qū)胧荏w細胞第1次拼接第2次拼接第1次導入第2次導入該過程經(jīng)過____次拼接、____次導入？1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關系？T-DNA不是目的基因，但它將來會被整合到宿主細胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進入宿主細胞并整合到宿主細胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進入植物的一個體細胞中，但基因工程最終要的是一個轉(zhuǎn)基因植株，如何實現(xiàn)這一目標？

得到含有目的基因的植物細胞后進行植物組織培養(yǎng)思考討論：03將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片__________________，然后________________，并_____________。受體細胞為_______與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化細胞再生成植株體細胞b.可以將_______直接浸沒在___________________中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得_______，再進行________、_________等。受體細胞為_______花序含有農(nóng)桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵（1）將目的基因?qū)胫参锛毎?-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①用______________將________________________直接注入_______中。微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去______，將____________滴加在_________上，使目的基因借助________________進入_______。柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受體細胞：受精卵子房花粉柱頭花粉管精子卵細胞胚囊（1）將目的基因?qū)胫参锛毎?-花粉管通道法我國科學家獨創(chuàng)的將Bt基因?qū)朊藁毎姆椒ɑǚ酃芡ǖ婪ㄊ俏覈茖W家周光宇在1987年獨創(chuàng)的。將重組DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道內(nèi)，進入卵細胞、合子或早期胚胎細胞中。此方法直接、簡便且經(jīng)濟，已應用于水稻、小麥、棉花、大豆等多種植物中。03將目的基因?qū)胧荏w細胞②操作過程：為什么常選受精卵作為受體細胞呢？（2）將目的基因?qū)雱游锛毎?-顯微注射法①體積大，易操作。②全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。構(gòu)建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植（移植到同期發(fā)情的母畜子宮內(nèi)）獲得具有新性狀的動物①受體細胞：受精卵拓展：【其他方法】科學家也用病毒DNA

與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因?qū)雱游锛毎麅?nèi)。如慢病毒載體、腺病毒載體等。（2）將目的基因?qū)雱游锛毎?3選