快速核酸檢測儀校準規(guī)范1 范圍本規(guī)范適用于將核酸提取、擴增檢測一體化運行，基于控溫基因擴增技術的快速核酸檢測儀的校準，其他類似設備也可參照本規(guī)范進行校準。2 引用文件本規(guī)范引用了下列文件：JJF1007-2007溫度計量名詞術語及定義JJF1101-2019環(huán)境試驗設備溫度、濕度參數(shù)校準規(guī)范JJF1265-2010生物計量術語及定義JJF1527-2015聚合酶鏈反應分析儀校準規(guī)范YY∕T1173-2010聚合酶鏈反應分析儀其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。術語JJF1265-2010、JJF1527-2015、YY∕T1173-2010中界定的以下術語和定義適用于本規(guī)范。3.1核酸nucleicacid由核苷酸或脫氧核苷酸通過3′，5ˊ-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。具有非常重要的生物功能，主要是貯存遺傳信息和傳遞遺傳信息。包括核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）兩類。[來源：JJF1265-2010，4.42]閾值循環(huán)數(shù)Ctcyclethreshold實時檢測擴增過程中，反應管內(nèi)的熒光信號到達指數(shù)擴增時經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主1要的計算方式是以擴增過程前3～15個循環(huán)的熒光值的10倍標準差為閾值，當熒光值超過閾值時的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。[來源：YY/T1173-2010，3.15]3.3等溫擴增技術isothermalamplificationtechnology反應過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物來達到快速核酸擴增目的技術。3.4拷貝數(shù)copynumber特定基因（可以是質粒）在某一生物體基因組中所含的個數(shù)，以及每個生物細胞中所具有的轉錄物（RNA）個數(shù)。[來源：JJF1265-2010，4.29]3.5溫度偏差temperaturedeviation恒溫過程中模塊內(nèi)實測溫度平均值與設定溫度之差。3.6平均升溫速率meanheatingrate升溫過程中模塊單位時間內(nèi)上升的平均溫度度數(shù)。[來源：YY/T1173-2010，3.4]3.7平均降溫速率meancoolingrate降溫過程中模塊單位時間內(nèi)下降的平均溫度度數(shù)。[來源：YY/T1173-2010，3.6]3.8平均過沖溫度averagetemperatureovershoot從基礎溫度升溫或降溫至設定溫度時模塊內(nèi)實測溫度偏離設定溫度的幅度。3.9溫度波動度temperaturefluctuation恒溫過程中模塊內(nèi)實測溫度隨時間的變化量。3.10持續(xù)時間durationtime恒溫過程中模塊內(nèi)維持溫度的時間。24 概述快速核酸檢測儀通常是基于實時熒光PCR技術或等溫擴增技術的小型化檢測儀器，將核酸提取和擴增整合到一個設備，在短時間內(nèi)完成對核酸的擴增檢測?？焖俸怂釞z測儀主要由反應模塊、光源模塊、磁導模塊、加熱模塊、光電檢測系統(tǒng)、顯示模塊等部分組成，需與專用的核酸檢測試劑盒配套使用。5 計量特性儀器計量特性見表1。表1快速核酸檢測儀計量特性類型實時熒光PCR溫度偏差≤±0.5℃平均升溫速率≥3℃/s-平均降溫速率≥2℃/s-平均過沖溫度≤2℃-溫度波動度-持續(xù)時間偏差≤±10%-樣本檢測重復性≤5%注：以上所有技術指標不用于合格性判別，僅供參考。6 校準條件6.1環(huán)境條件溫度：（10～40）℃；相對濕度：不大于85%。6.2測量標準及其他設備測量標準、其他設備及技術要求見表2。3表2測量標準、其他設備及技術要求序號名稱規(guī)格技術要求1度校準裝置溫度（0～120）℃分辨力：不低于0.01℃最大允許誤差：0.1℃采樣時間間隔：≤0.1s2時間/分辨力：不低于1s最大允許誤差：1s/h3新型冠狀病毒核酸標準物質ORFlab基因定值有證標準物質N基因定值有證標準物質4移液器（2.5、10、100、200、1000、5000）μL檢定合格質為例，若快速核酸檢測儀用于檢測其他病原體可采用相應的有證標準物質。7 校準項目和校準方法7.1校準項目基于實時熒光PCR技術和等溫擴增技術的快速核酸檢測儀校準項目見表3。表3快速核酸檢測儀校準項目項目實時熒光PCR等溫擴增技術溫度偏差++平均升溫速率+-平均降溫速率+-平均過沖溫度+-溫度波動度-+持續(xù)時間偏差+-樣本檢測重復性++注：+表示應校準；-表示不校準。7.2溫度校準7.2.1測量方法4獨立控溫模塊快速核酸檢測儀可逐個模塊校準或同時對多個模塊分別校準，參照圖1所示。非獨立控溫的快速核酸檢測儀作為一個整體進行溫度校準，以8通道、16通道快速核酸檢測儀為例，布點遵循均勻分布的原則，可參照圖2（a）和圖2（b）所示，每增加8通道可增加3個點。多模塊或多通道的快速核酸檢測儀以所有布點計算結果的最大值作為測量結果?；趯崟r熒光PCR技術的快速核酸檢測儀控溫程序設置可參照表4進行，設置溫度采樣間隔為0.1s?；诘葴財U增技術的快速核酸檢測儀溫度設定程序可參照表5進行。將溫度數(shù)據(jù)。圖1獨立模塊快速核酸檢測儀布點示意圖圖2（a）8通道快速核酸檢測儀布點示意圖圖2（b）16通道快速核酸檢測儀布點示意圖5表4基于實時熒光PCR技術快速核酸檢測儀控溫程序步驟設定溫度點/℃設定溫度持續(xù)時間/s循環(huán)數(shù)150101290101340106495105701016601074010表5基于等溫擴增技術快速核酸檢測儀控溫程序步驟設定溫度點/℃設定溫度持續(xù)時間/min溫度采樣間隔/s155103026010307.2.2溫度偏差計算（）（）式中：——模塊溫度偏差，℃；——該模塊溫度實測值的平均值，℃；——模塊設定溫度，℃；——該模塊校準裝置第i次的測量值，℃；——測量次數(shù)。7.2.3平均升溫速率計算（實時熒光PCR技術）從40℃升至95℃過程中截取50℃至90℃的溫度曲線如圖3所示（取溫度達到50℃6和90℃后采集的第一個值）計算升溫速率，平均升溫速率按照公式（3）、（4）計算：（3）（）式中：——模塊第i個循環(huán)升溫速率，℃/s；——模塊平均升溫速率，℃/s；——50℃溫度點測量值，℃；——90℃溫度點測量值，℃；——從到達的時間，s；——累積循環(huán)數(shù)，按本規(guī)范程序設置為6。圖3升降溫速率取點示意圖7.2.4平均降溫速率計算（實時熒光PCR技術）從95℃降至40℃過程中截取90℃至50℃的溫度曲線如圖3所示（取溫度降至90℃和（5）（6）式中：——模塊第i個循環(huán)升溫速率，℃/s；——模塊平均升溫速率，℃/s；7——50℃溫度點測量值，℃；——90℃溫度點測量值，℃；——從到達的時間，s；——累積循環(huán)數(shù)，按本規(guī)范程序設置為6。7.2.5平均過沖溫度計算（實時熒光PCR技術）模塊溫度從40℃升溫至設定溫度95℃或從95℃降溫至設定溫度40℃時模塊內(nèi)實測溫度偏離設定溫度的溫度值，如圖4所示。平均升溫過沖溫度按照公式（7）、（8）計算，平均降溫過沖溫度按照公式（9）、（10）計算。式中：——模塊升溫平均過沖溫度，℃；——模塊設定溫度值，95℃；——該模塊各循環(huán)升溫實測最大過沖溫度平均值，℃；——模塊第i個循環(huán)升溫實測最大過沖溫度，℃；——模塊降溫平均過沖溫度，℃；——模塊設定溫度值，40℃；——該模塊各循環(huán)降溫實測最大過沖溫度平均值，℃；——模塊第i個循環(huán)降溫實測最大過沖溫度，℃；——累積循環(huán)數(shù)，按本規(guī)范程序設置為6。8圖4單循環(huán)過沖溫度示意圖7.2.6溫度波動度計算（等溫擴增技術）溫度波動度按照公式（11）計算：式中：——模塊溫度波動度，℃；——模塊恒溫時間內(nèi)實測最高溫度，℃；——模塊恒溫時間內(nèi)實測最低溫度，℃。7.2.7持續(xù)時間偏差計算（實時熒光PCR技術）、取點示意圖如圖5所示，持續(xù)時間的偏差按照公式（12）、（13）計算：（12）（13）式中：——持續(xù)時間偏差，s；——實際持續(xù)時間，s；——設定持續(xù)時間，s；——校準裝置采集到的第一個到達設定溫度的時刻；——校準裝置采集到的最后一個維持設定溫度的時刻。9圖5、取點示意圖7.3樣本檢測重復性樣本檢測重復性用變異系數(shù)表示。將標準物質稀釋到高于檢出限的一定濃度（比如1000copies/mL）作為樣本，對同一模塊或通道進行6次或6次以上重復性檢測，分別記錄ORFlab基因和N基因的Ct值。按照公式（14）計算。（14）式中：——變異系數(shù)；——標準差；——測量結果的平均值。多模塊或多通道的快速核酸檢測儀可以根據(jù)用戶要求進行。8 校準結果表達8.1校準記錄校準記錄格式參見附錄A。8.2校準結果的處理校準證書內(nèi)頁格式參見附錄B，校準證書應至少包括以下內(nèi)容：10標題：“校準證書”；實驗室名稱和地址；進行校準的地點（如果與實驗室地址不同）；證書的唯一性標識（如編號），每頁及總頁數(shù)的標識；客戶的名稱和地址；被校準設備的描述和明確標識；進行校準的日期，如果與校準結果的有效性或應用有關時，應說明被校對象接收日期；如果與校準結果的有效性或應用有關時，應對被校樣品的抽樣程序進行說明；校準所依據(jù)的技術規(guī)范的標識，包括名稱及代號；本次校準所用測量標準的溯源性及有效性說明；校準環(huán)境的描述；校準結果及測量不確定度的說明；對校準規(guī)范的偏離的說明；校準證書或校準報告簽發(fā)人的簽名、職務或等效標識；校準結果僅對被校設備有效的聲明；未經(jīng)實驗室書面批準，不得部分復制證書的聲明。復校時間間隔建議復校間隔時間為1年，使用特別頻繁時應適當縮短。凡在使用過程中經(jīng)過修理、更換重要器件等一般需要重新校準。因素所決定，因此，用戶可根據(jù)實際使用情況確定復校時間間隔。11附錄A快速核酸檢測儀校準結果記錄參考格式委托單位儀器名稱制造廠型號規(guī)格出廠編號校準地點校準日期環(huán)境溫度℃環(huán)境相對濕度％校準員校準依據(jù)核驗員本次校準用標準器信息：標準器名稱標準器編號型號/規(guī)格制造單位溯源單證書編號有效期至準確度等/最大允許誤差/不確定度1、外觀及工作正常性檢查：2、溫度偏差值/℃實測溫度值/℃平均值/℃溫度偏差/℃123456……3、平均升溫速率（實時熒光PCR技術溫度設定值/℃測量點123456……時間差/s升溫速率/(℃/s)平均升溫速率/(℃/s)124、平均降溫速率（實時熒光PCR技術溫度設定值/℃測量點123456……時間差/s降溫速率/(℃/s)平均降溫速率/(℃/s)5、平均過沖溫度（實時熒光PCR技術或測量值/℃123456……或或6、溫度波動度（等溫擴增技術溫度值/℃測量值/℃7、持續(xù)時間偏差（實時熒光PCR技術時刻設定值/s持續(xù)時間/s偏差/s8、樣本檢測重復性核酸濃度（copies/μL）Ct變異系數(shù)13附錄B快速核酸檢測儀校準證書內(nèi)頁參考格式1.布點示意圖如B.1所示。校 準 結 果圖B.1布點示意圖2.校準結果：校準項目校準結果擴展不確定度（k=2）溫度偏差/℃平均升溫速率/(℃/s)平均降溫速率/(℃/s)升溫平均過沖溫度/℃降溫平均過沖溫度/℃溫度波動度/℃持續(xù)時間偏差/s樣本檢測重復性/14附錄CC.1方法概述

快速核酸檢測儀溫度偏差測量不確定度評定示例用專用無線溫度校準裝置對一臺基于實時熒光PCR技術的快速核酸檢測儀單模塊分別在40℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃進行校準，記錄各點測量值。C.2測量模型溫度偏差可表示為：式中：——模塊溫度偏差，℃；——該模塊溫度實測值的平均值，℃；——模塊設定溫度，℃。靈敏系數(shù)=1=-1C.3不確定度分量C.3.1測量重復性引入的標準不確定度分量在各個溫度點采集數(shù)據(jù)見表C.1。表C.1測量重復性數(shù)據(jù) 單位：℃設定溫度實測溫度平均溫度4040.99、40.94、40.89、40.85、40.81、40.77、40.73、40.69、40.66、40.63、40.60、40.56、40.54、40.51、40.49、40.46、40.44、40.42、40.40、40.38、40.37、40.35、40.33、40.32、40.30、40.29、40.28、40.27、40.26、40.25、40.23、40.23、40.22、40.21、40.20、40.20、40.19、40.19、40.18、40.18、40.17、40.17、40.17、40.17、40.16、40.16、40.16、40.16、40.16、40.16、40.16、40.16、40.16、40.16、40.16、40.17、40.17、40.17、40.17、40.18、40.18、40.18、40.19、40.19、40.19、40.19、40.20、40.20、40.21、40.22、40.22、40.23、40.23、40.24、40.25、40.25、40.26、40.27、40.27、40.28、40.29、40.30、40.30、40.31、40.32、40.33、40.34、40.34、40.35、40.36、40.37、40.38、40.39、40.40、40.41、40.41、40.43、40.43、40.45、40.46、40.33155050.29、50.24、50.21、50.17、50.13、50.09、50.05、50.03、50.00、49.97、49.94、49.91、49.88、49.86、49.84、49.81、49.79、49.77、49.75、49.73、49.71、49.70、49.68、49.67、49.66、49.65、49.63、49.62、49.62、49.61、49.60、49.60、49.58、49.58、49.57、49.57、49.57、49.56、49.56、49.56、49.56、49.56、49.56、49.56、49.55、49.55、49.56、49.56、49.57、49.57、49.57、49.57、49.58、49.59、49.59、49.60、49.60、49.61、49.61、49.62、49.62、49.64、49.64、49.65、49.66、49.67、49.68、49.68、49.70、49.70、49.71、49.72、49.74、49.74、49.75、49.76、49.77、49.79、49.80、49.81、49.82、49.83、49.85、49.86、49.87、49.88、49.89、49.91、49.92、49.94、49.94、49.97、49.97、49.99、50.00、50.02、50.04、50.05、50.07、50.08、49.766060.02、59.96、59.91、59.86、59.81、59.77、59.74、59.69、59.66、59.63、59.60、59.58、59.55、59.52、59.50、59.49、59.47、59.45、59.43、59.42、59.39、59.39、59.37、59.36、59.35、59.34、59.33、59.32、59.31、59.31、59.30、59.30、59.29、59.28、59.28、59.28、59.27、59.27、59.27、59.26、59.27、59.27、59.26、59.27、59.27、59.26、59.27、59.27、59.27、59.27、59.27、59.28、59.28、59.29、59.29、59.30、59.30、59.31、59.31、59.32、59.33、59.33、59.34、59.34、59.36、59.37、59.37、59.38、59.39、59.41、59.42、59.43、59.45、59.45、59.46、59.48、59.49、59.50、59.52、59.54、59.55、59.57、59.59、59.60、59.62、59.63、59.66、59.67、59.69、59.72、59.74、59.76、59.77、59.80、59.82、59.85、59.87、59.89、59.91、59.93、59.487070.06、70.12、70.16、70.22、70.27、70.32、70.36、70.41、70.45、70.50、70.53、70.58、70.61、70.65、70.68、70.72、70.75、70.78、70.81、70.84、70.87、70.89、70.93、70.95、70.98、71.00、71.03、71.04、71.06、71.07、71.09、71.11、71.12、71.14、71.15、71.17、71.17、71.18、71.18、71.18、71.20、71.20、71.20、71.22、71.20、71.22、71.22、71.22、71.22、71.20、71.20、71.20、71.20、71.20、71.18、71.18、71.17、71.17、71.15、71.15、71.14、71.14、71.12、71.12、71.11、71.09、71.07、71.07、71.06、71.04、71.03、71.03、71.00、70.98、70.98、70.96、70.95、70.93、70.92、70.92、70.90、70.89、70.87、70.87、70.86、70.86、70.84、70.84、70.82、70.81、70.81、70.81、70.79、70.79、70.79、70.78、70.78、70.76、70.76、70.76、70.929090.17、90.23、90.29、90.35、90.38、90.43、90.49、90.52、90.58、90.60、90.66、90.69、90.75、90.78、90.81、90.83、90.86、90.89、90.92、90.95、90.98、91.01、91.04、91.07、91.10、91.10、91.13、91.15、91.15、91.18、91.18、91.21、91.21、91.24、91.24、91.27、91.27、91.27、91.30、91.30、91.30、91.30、91.33、91.33、91.33、91.33、91.30、91.30、91.33、91.30、91.33、91.30、91.30、91.30、91.30、91.30、91.27、91.27、91.27、91.24、91.24、91.24、91.24、91.21、91.21、91.18、91.18、91.18、91.15、91.15、91.13、91.13、91.10、91.07、91.07、91.07、91.04、91.04、91.01、90.98、90.95、90.95、90.92、90.92、90.89、90.86、90.86、90.83、90.81、90.78、90.78、90.78、90.75、90.72、90.69、90.66、90.66、90.63、90.60、90.5891.00169595.24、95.34、95.49、95.56、95.67、95.78、95.85、95.92、96.00、96.07、96.11、96.14、96.22、96.25、96.29、96.33、96.36、96.40、96.40、96.44、96.44、96.48、96.48、96.51、96.51、96.55、96.55、96.59、96.59、96.59、96.59、96.63、96.63、96.63、96.63、96.63、96.63、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.66、96.63、96.63、96.63、96.59、96.63、96.