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T/HBIQAT/HBIQA0009—20247-DeterminationofsevenpolykinasesinhumanbloodbyHPLC-MS/MS2024-08-15發(fā)布 2024-10-15實施河北省檢驗檢疫學會 發(fā)布T/HBIQA0009—2024前 言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由河北省檢驗檢疫學會提出并歸口。本文件起草單位：河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院、河北醫(yī)科大學藥學院。本文件主要起草人：李揮、梁艷、宋莉、李怡霖、劉亞楠。T/HBIQA0009T/HBIQA0009—2024PAGEPAGE11人體血液中7種多激酶類藥物含量的測定高效液相色譜-串聯(lián)質譜法范圍本文件規(guī)定了人體血液中7種多激酶類藥物含量的高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。原理樣品經(jīng)甲醇提取、無水硫酸鎂鹽析、N-丙基乙二胺（PSA）凈化后，渦旋混勻、冷凍離心、氮吹復溶，進行液相色譜-串聯(lián)質譜法測定，內標法定量。試劑和材料試劑和材料除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。甲醇：色譜純。甲酸：色譜純。無水硫酸鎂。N-丙基乙二胺（PSA）。5.1.5 標準品：索拉菲尼（CAS號：475207-59-1），阿西替尼（CAS號：319460-85-0）（CAS（CAS（CAS64735466AS7966716-3AS9283713-2）98%?；旌蠘藴蕛淙芤旱呐渲疲悍謩e稱取布立尼布、利尼伐尼、索拉菲尼、阿西替尼、戈伐1mg（0.01mg）10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別配制成布立尼布、利尼伐尼、索拉菲尼、阿西替尼、戈伐替尼、埃羅替尼、西地尼布的儲備溶液，于-20℃保存至分析。1mg（0.01mg）10mL量瓶中，用甲醇0.1mg/mL的內標儲備液，于-20℃保存至分析。500μL標準儲備溶液（5.1.6）50mL量瓶中，加甲醇稀釋，渦旋混勻，得到1μg/mL的標準中間溶液，于-20℃保存?zhèn)溆?。體積分數(shù)1.0mL1L儀器設備液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）。氮吹濃縮儀。渦旋振蕩器。電子分析天平（0.01mg)。高速冷凍離心機（22000rpm）。試樣制備4℃3000r/min10儲存待測。試驗步驟試樣預處理取200μL血液試樣（7）于5mL離心管中，準確加入1.0mL甲醇、250mg無水MgSO4、35mgPSA進行鹽析和凈化，渦旋混勻30s后，經(jīng)12000r/min，4℃冷凍離心10min。上清液全300μL300.22μm微孔濾膜，待測定。標準曲線7步驟進行處理，用得到的空白樣品提取液，將混合標準儲備溶液5、10、25、50、100、250、400500ng/mL10、20、50、100、200、500、800、1000ng/mL的系列混合標準工作溶液（100ng/mL），濃度由低到高儀器參考條件液相色譜參考條件色譜柱：ZorbaxRRHDStablebondAq（502.1mm，1.8μm），或相當者。流動相：A0.1%甲酸溶液；B相甲醇。柱溫：40℃。進樣體積：5μL。流速：0.3mL/min1：表1梯度洗脫程序表時間/min流動相A/%流動相B/50100301003.1703057030質譜參考條件電離方式：電噴霧電離，正離子模式。電噴霧電壓：3500V。50Arb。輔助氣流速：10Arb。離子傳輸溫度：325℃。.霧化溫度：350℃。e.碰撞氣：氬氣。其他質譜條件見附錄A。測定測定步驟將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質譜儀中，得到7種多激酶抑制劑的質譜響應值，根據(jù)標準曲7（定性判定在相同條件測定樣品溶液和標準溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時間與標準溶液中的某種組分峰的保留時間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對子離子的質荷比一致，樣品溶液中定性離子相對豐度與濃度相當標準工作溶液中定性離子的相對豐度進行比較時，2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在該組分。7種多激酶抑制劑標準物質的色譜圖參見附錄B。表2定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度＞50%＞20%~50%＞10%~20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%數(shù)據(jù)計算血液樣本中各藥物濃度含量為：式中:Xi——試樣中待測組分含量，單位為納克每毫升(ng/mL)；ρi——由標準曲線得出的測試液中某種組分的質量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；V——定容體積，單位為毫升(mL)；K——稀釋倍數(shù)；V試樣——試樣體積，單位為毫升(mL)。計算結果保留三位有效數(shù)字。空白試驗取空白血樣，按8.1-8.4測定步驟進行。定量限和重復性定量限本方法索拉菲尼、布立尼布、利尼伐尼、阿西替尼、戈伐替尼的定量限為5ng/mL，西地尼布、埃羅替尼的定量限為10ng/mL。重復性在重復性實驗條件下獲得兩次獨立實驗結果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的15%。附錄A（資料性附錄）質譜參數(shù)表A.1目標物的質譜參數(shù)和參考保留時間名稱母離子(m/z)子離子(m/z)碎裂電壓(V)碰撞電壓(V)保留時間(min)索拉菲尼465.1252.0a/270.013633/241.50阿西替尼387.1220.9a/355.97751/201.16多韋替尼393.1334.0a/336.08627/291.11埃羅替尼394.1278.0a/336.010131/241.14西地尼布451.284.0a/112.07345/241.14布立尼布371.2149.0a/331.08733/251.40利尼伐尼376.2207.0a/251.08445/261.34戈伐替尼634.2184.0a/451.07922/291.12a代表定量離子附錄B（資料性附錄）ⅠⅠ