ICS65.020.20DB23052024-08-30發(fā)布雙鴨山市市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB2305/T040—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由雙鴨山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院、寶清縣小城子鎮(zhèn)鄉(xiāng)村振興發(fā)展服務(wù)中心、蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院。本文件主要起草人：楊曉賀、姚亮亮、于昌紅、顧鑫、吳彥龍、高忠臣、丁俊杰、高雪冬、邱磊、張茂明、王自杰、張家智、付久才、馬瑞、劉偉、王慶勝、黃成亮。1DB2305/T040—2024水稻紋枯病菌分離及鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了水稻紋枯病樣本的采集與保存，病原菌的分離、純化、鑒定及保存技術(shù)要求。本文件適用于水稻紋枯病菌的分離和鑒定。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1水稻紋枯病由立枯絲核菌侵染引起的一種水稻真菌病害，主要危害葉鞘、葉片形成云紋狀病斑。田間癥狀見附錄A。3.2單菌絲分離利用真菌培養(yǎng)時不產(chǎn)生分生孢子而產(chǎn)生快速生長菌絲的特點，切取菌絲前端進(jìn)行菌絲分離，以獲得純化菌株。4儀器和用具4.1常用儀器4.1.1超凈工作臺潔凈等級100級@≥0.5um。平均風(fēng)速0.25m/s～0.6m/s。4.1.2高壓滅菌鍋穩(wěn)定范圍0℃~135℃。滅菌時間范圍4min～120min，最高工作壓力0.22MPa～0.25MPa。4.1.3光照培養(yǎng)箱穩(wěn)定范圍0℃~50℃。穩(wěn)定波動±1℃。光照度0LX～7500LX。2DB2305/T040—20244.1.4光學(xué)顯微鏡4.1.5電子天平感量0.01g。4.1.6常用工具剪刀、培養(yǎng)皿、吸水紙、接種針、試管、酒精燈、記號筆、載玻片、蓋玻片、鑷子，醫(yī)用紗布等。5樣本采集與保存水稻成熟期從田間剪取發(fā)病莖稈（其特征見附錄B），按品種及采集地裝入牛皮紙袋，貼上標(biāo)簽，注明采集時間、地點和水稻品種，帶回實驗室。放置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?分離技術(shù)6.1培養(yǎng)基的配制6.1.1水瓊脂培養(yǎng)基將20g瓊脂粉加水煮沸后定容至1000mL，配制成2%水瓊脂培養(yǎng)基。121℃濕熱滅菌25min。6.1.2馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）將去皮馬鈴薯200g切成小塊，加水1000mL煮沸25min，用四層紗布過濾，過濾后加入瓊脂20g，再煮沸后加入葡萄糖20g，加水定容至1000mL，121℃濕熱滅菌25min。6.2病菌分離將病組織用自來水沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水珠，將病組織剪成長寬各2mm×5mm的小塊，將其放置于水瓊脂平板上，每個平板放置5塊病組織，置于25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（見附錄C）。培養(yǎng)24h后，病組織周圍即可長出具有立枯絲核菌菌落特征的菌落（見附錄D），在無菌操作臺內(nèi)切取菌落邊緣的菌絲前端，置于PDA平板上純化。6.3病菌的純化單菌絲分離將水稻紋枯病菌置于水瓊脂平板上，25℃培養(yǎng)2d后，用切刀切取菌絲前端約1mm長度的菌絲置于水瓊脂平板上，25℃培養(yǎng)。如此操作3次。7菌種保存3DB2305/T040—2024將6.3純化的菌株轉(zhuǎn)入PDA試管斜面內(nèi)，25℃培養(yǎng)15d，放置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫ㄒ姼戒汦）。8病原菌的鑒定形態(tài)學(xué)觀察法。選取干凈的載玻片，在載玻片上用吸管放置適量清水，挑起純化后的病原菌的菌絲放置清水上，蓋上蓋玻片，利用光學(xué)顯微鏡顯微觀察。參照立枯絲核菌形態(tài)學(xué)典型特征（附錄F）進(jìn)行比對，確定其為水稻紋枯病菌。9病原菌的致病性測定將牙簽剪成1cm短簽，經(jīng)121℃濕熱滅菌30min后，將短簽放置在PDA平板上，1個PDA平板內(nèi)放置20個左右短牙簽。將待測菌株接種至裝有短牙簽的PDA平板內(nèi)，28℃培養(yǎng)7d～10d，將帶有菌絲的短牙簽接種至水稻葉鞘內(nèi)（見附錄G），接種72h后觀察，出現(xiàn)典型水稻紋枯病癥狀（附錄H），將發(fā)病葉鞘采集至實驗室，重復(fù)6.2、6.3和8操作，確定其為水稻紋枯病菌。4DB2305/T040—2024水稻紋枯病田間癥狀水稻紋枯病田間發(fā)病初期，葉鞘呈現(xiàn)云紋狀病斑，生育后期形成菌核。水稻紋枯病田間發(fā)病癥狀特征見圖A.1。圖A.1水稻紋枯病發(fā)病莖稈5DB2305/T040—2024水稻紋枯病標(biāo)本特征水稻紋枯病發(fā)生于葉鞘、葉片及穗部。用于水稻紋枯病菌分離的標(biāo)本以發(fā)病莖稈為宜。水稻紋枯病發(fā)病莖稈癥狀特征見圖B.1。圖B.1水稻紋枯病發(fā)病莖稈標(biāo)本6DB2305/T040—2024水稻紋枯病菌分離培養(yǎng)皿將清洗干凈并用吸水紙吸干水分的水稻紋枯病發(fā)病葉鞘樣本進(jìn)行剪切，剪成2cm×5cm的小塊，將其放入水瓊脂平板上，每個平板放置5塊病組織，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分離培養(yǎng)皿內(nèi)樣本擺放，見圖C.1。圖C.1分離培養(yǎng)皿內(nèi)樣本擺放7DB2305/T040—2024立枯絲核菌特征的菌落立枯絲核菌菌落生長快，菌絲平鋪生長，起初白色，圖D.1為立枯絲核菌25℃培養(yǎng)36h菌落特征。圖D.1立枯絲核菌25℃培養(yǎng)36h菌落特征8DB2305/T040—2024水稻紋枯病菌的保存純化的水稻紋枯病菌菌株轉(zhuǎn)入PDA試管斜面內(nèi)，25℃培養(yǎng)15d，放置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)?。圖E.1為4℃冰箱內(nèi)保存30d的立枯絲核菌菌株P(guān)DA試管斜面。圖E.14℃冰箱內(nèi)保存30d的立枯絲核菌菌株P(guān)DA試管斜面9DB2305/T040—2024立枯絲核菌形態(tài)學(xué)典型特征立枯絲核菌菌落生長快，菌絲平鋪生長，粉狀，起初白色，后逐漸變褐色，背面變褐；不育菌絲直角分枝，分枝處有縊縮，縊縮處寬5μm～8μm；念珠狀細(xì)胞成串向頂部生長；7d后可產(chǎn)生肉眼可見的菌核，菌核初為白色菌絲糾結(jié)在一起形成的團(tuán)狀物，后期變褐色，堅硬，大小不一，1mm~2mm。見圖F.1.BACA圖F.1立枯絲核菌A.PDA上5d菌落及其背面B.菌絲直角分枝C.念珠狀細(xì)胞DB2305/T040—2024短牙簽接種將牙簽剪成1cm短牙簽，短牙簽經(jīng)121℃濕熱滅菌30min后，將牙簽放置在PDA平板上，1個PDA平板內(nèi)放置20個左右短牙簽。將待測菌株接種至裝有短牙簽的PDA平板內(nèi)，28℃培養(yǎng)7d～10d，將帶有菌絲的短牙簽接種至水稻葉鞘內(nèi)（附錄