第五章DNA分子基本操作技術122013年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎北京時間10月7日下午5點30分，美國、德國三位科學家詹姆斯-E.羅斯曼、蘭迪-W.謝克曼及托馬斯-C.蘇德霍夫因在細胞內運輸系統(tǒng)領域的新發(fā)現(xiàn)而獲得今年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。諾獎委員會說，三人發(fā)現(xiàn)了細胞囊泡交通的運行與調節(jié)機制。3膜融合的發(fā)現(xiàn)表明蛋白質和其他物質可以在細胞內和細胞間進行傳遞，細胞可以用這一過程來阻止它們的活動并且避免混亂。這一突破性發(fā)現(xiàn)解釋了為什么胰島素釋入血液時會有變化、神經細胞之間的信息傳達，以及病毒感染細胞的方式。

4生物體內細胞的正常運轉有賴于讓合適的分子在合適的時間抵達合適的位置。一部分分子，如胰島素，需要被轉運出細胞之外，而其他分子則需要被在細胞內部進行運輸。細胞內部產生的分子被包裹于囊泡之中（圖中藍色表示），但是這些囊泡具體是如何達成這種精準的運輸?shù)模窟@一點一直沒有被理解。5RandyW.Schekman發(fā)現(xiàn)基因控制下的蛋白質在這種囊泡運輸機制中起到重要作用。正如這里的圖上所展示的那樣，通過對比正常酵母菌細胞（左）和轉運機制缺陷的細胞（右），他成功識別出操控這一轉運過程的基因。6JamesE.Rothman發(fā)現(xiàn)一種蛋白質化合物（圖中橘色表示）可以讓囊泡實現(xiàn)與目標細胞膜的融合。囊泡上的蛋白質物質會與目標細胞膜上的特定蛋白質之間發(fā)生結合，從而讓囊泡可以在正確的位置上釋放其所運載的特殊“分子貨物”。7ThomasC.Südhof研究了大腦中神經細胞之間是如何互相傳遞信號的，以及鈣離子在這一過程中所起的作用。他識別出一種分子機制（圖中用紫色表示），其可以對進入的鈣離子發(fā)生反應并觸發(fā)囊泡融合，從而解釋了囊泡輸運機制中時間的精確性是如何達成的，以及其所攜帶的信號分子物質是如何能做到受控釋放。8約翰.戈登山中伸彌獲獎理由：發(fā)現(xiàn)成熟細胞可被重編程變?yōu)槎嗄苄?2012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎第五章

DNA分子基本操作技術10

從20世紀中葉開始，分子生物學研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術的進步。

基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研究的核心技術。11本章內容第一節(jié)核酸凝膠電泳技術第二節(jié)核酸分子雜交第三節(jié)PCR第四節(jié)轉化第五節(jié)基因組文庫構建第六節(jié)RNA操作技術第七節(jié)基因克隆12一、常規(guī)電泳

瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳二、脈沖凝膠電泳第一節(jié)核酸凝膠電泳技術13一、常規(guī)電泳自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術基礎，受到科學界的高度重視。

基本原理：生物大分子在一定pH條件下，通常會帶電荷。將其放置到電場中，就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。分子在電場作用下的遷移速度，與電場強度和電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質粘度的函數(shù)。根據(jù)分子大小、構型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離。14在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場當中，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。這就是應用凝膠電泳技術分離DNA片段的基本原理。大分子量的DNA移動的慢小分子量的DNA移動的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔1516171、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是一種簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物根據(jù)瓊溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖低熔點瓊脂糖熔點為62～65℃，溶解后在37℃下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于DNA片段的回收，質粒與外源性DNA的快速連接等181）凝膠濃度選擇瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍19凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關，凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。2）電泳緩沖液常用三種緩沖液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀TAE：緩沖容量低，但價格較便宜。緩沖液中的EDTA可螯合二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴增產物降解2010×TBE緩沖液的配制配方Tris108克EDTA9.3克硼酸55克H2O至1000mlpH應為8.0～8.2臨用時用水稀至0.5×TBE（20倍稀釋）213）核酸電泳的指示劑指示劑：溴酚蘭二甲苯青溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色瓊脂糖凝膠濃度0.6%1%1.4%2%遷移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb22核酸電泳的指示劑二甲苯青：水溶液呈蘭色電泳時，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%遷移率2Kb1.6Kb234）載樣緩沖液指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液作用：①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預測核酸電泳的速度和位置③使樣品呈色，使加樣操作更方便24溴化乙錠染料的化學結構及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。255）核酸電泳的染色劑在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（ethidiumbromide，簡稱EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。在紫外線的照射下結合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光26瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間27稱樣溶解加熱制板倒膠6）核酸電泳操作基本程序28取樣點樣電泳檢測核酸電泳操作基本程序29結果30根據(jù)標準DNA相對遷移距離推測待測定的DNA片段的大小31Agarosegelelectrophoresis322、聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長度僅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分離33聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間34聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED（N，N，N，N‘一四甲基乙二胺）和過硫酸銨（AP）的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的351）不同濃度丙烯酰胺和DNA有效分離范圍

丙烯酰胺（%）有效分離范圍（bp）溴酚蘭*二甲苯青*3.5100～20001004605.080～500652608.060～4004516012.040～200307015.025～150156020.010～1001245362）材料電泳儀器：電泳儀垂直電泳槽及其附件.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N‘一亞甲基雙丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml

裝于棕色瓶內，4℃可保存二個月372）材料10%過硫酸銨過硫酰銨，1克，加水至10ml

4℃可保存一周，-20℃可保存一個月1×TBE電泳緩沖液TEMED（四甲基乙烯基二胺）383）聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳配膠：根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角按表配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù)加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為止39立即插入適當?shù)氖嶙樱芮凶⒁夥乐故猃X下產生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機會室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1×TBE緩沖液40小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因為梳子取出后，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內聚合，產生不規(guī)則的表面，將導致以后DNA電泳帶型不規(guī)則將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內，加樣時不要產生氣泡41接好電極，電壓為1-8V/cm，進行電泳電泳畢，切斷電源，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶液中，15～30min后取出水洗，紫外儀下觀察結果聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出>10ng以上量的DNA條帶（要求更高的靈敏度，可用銀染）4243電泳結果分析DNAMarker

λDNA人工片段100bpladder44酶切分析根據(jù)PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶進行酶切酶切產物電泳分離后，獲得符合理論的片段此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究4546PCR-RFLP46二、脈沖凝膠電泳(PFGE)普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳。超過一定大小的線狀DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長度（50Kb）后DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關，在常規(guī)電泳凝膠中彼此擠壓，形成單一DNA遷移帶。1984年Schwartz和Cantor首次利用脈沖凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PEGE）解決了這一問題。4748PFGE工作的基本原理PFGE工作的基本原理

這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間取決于它的大小，小分子DNA比大分子DNA更容易在凝膠中重新定位，因而遷移速度更快。該法可分離長至10Mb的DNA分子。B+A-+A-B49A-+AB-+B正交交變電泳凝膠電泳(OFAGE)電場逆轉凝膠電泳(FIGE)夾角等值均一電場(CHEF)旋轉膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+PEGE類型50影響PFGE分辨率的因素1、脈沖時間（0.1s-1000s）：增加脈沖時間分離較大分子，減少脈沖時間分離較小分子。2、電壓：若固定脈沖時間，增加電場強度就增大了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場強度會導致較小片段泳動的紊亂。3、電場夾角：電場方向的夾角常為110O-120O，研究證實90O夾角也非常有效。4、溫度：標準瓊脂糖電泳基本在室溫進行，PFGE一般應在4℃進行。較高的溫度DNA泳動較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動截留和明顯的條帶變寬。51第二節(jié)核酸分子雜交

核酸分子雜交技術，是在1968年由華盛頓卡內基學院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。

52核酸的分子雜交將帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應的同源區(qū)段就會退火形成雙鏈結構。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。53不同溫度下DNA的構型變化一54不同溫度下DNA的構型變化二55

雜種核酸分子：

彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，而形成的雙鏈分子。

DNA/DNA的雜交作用檢測特定生物有機體之間的親源關系

DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。56一、核酸雜交常用幾種膜的性能比較571、硝酸纖維素膜

不能滯留小于150bp的DNA片段，不能同RNA結合。

改進：應用1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對小片段DNA的滯留能力。

RNA變性后也能十分容易的結合到膜上。58

尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟：

1.核酸印跡轉移：將核酸樣品轉移到固體支持膜上。利用的是毛細管作用

2.印跡雜交：將具有核酸印跡的濾膜同帶有標記的DNA/RNA進行雜交。592、Southern（薩瑟恩）DNA印跡雜交

根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。由于它是由E.Southern于1975年首先設計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉移技術。60Southern印跡分析基本流程濾紙NC膜凝膠濾紙電泳 轉移雜交，顯影酶切DNA樣品上樣 DNA印跡重物緩沖液61雜交模式圖放射自顯影DNA印跡轉移探針雜交－＋62Southern雜交(Southernbloting)的主要步驟待測DNA樣品的制備、酶切待測DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細管虹吸印跡法、電轉印法、真空轉移法探針的制備

Southern雜交雜交結果的檢測6364（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉移雜交技術656667SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。68SouthernBlotting的過程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過電泳液的移動轉移膠中的DNA3.固定膠中的DNA4.預雜交和雜交（放射性和熒光檢測）5.結果檢測69在理想條件下，應用放射性同位素標記的特異性探針和放射自顯影技術，即便每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。由于放射性同位素對人體的危害，近年來又發(fā)展了熒光法檢測雜交信號的技術，雖然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實驗變得更為安全。常用的熒光染料：C5、C3等703、諾賽恩RNA印跡技術（Northernblotting）

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術十分類似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術（Northernblotting）。而將蛋白質從電泳凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質之抗體進行反應，這種技術叫做韋斯頓蛋白質雜交技術（Westernblotting）。71

1、Northernblot基本原理和基本過程與Southernblot基本相同

2、用于鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段

4、待測樣品為總RNA或mRNA72Northern印跡與Southern印跡的不同點

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性

2、轉膜：RNA轉膜前不需變性和中和處理，Southern

印跡時，DNA轉膜前需進行堿變性及中和處理

3、靶核酸為RNA73Westernblotting（韋斯頓蛋白質雜交技術）將蛋白質從電泳凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質之抗體進行反應。Step1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigenStep2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopment744、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交

斑點印跡雜交（dotblotting）和狹線印跡雜交（slotblotting）是在Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的兩種類似的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術。由于在實驗的加樣過程中使用了特殊設計的加樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點陣或線陣。這兩項技術更適應于核酸樣品的定量檢測。75

1、斑點印跡為圓形

2、狹縫印跡為線狀

3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品

5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量76斑點印跡雜交將RNA或DNA直接點樣于NC膜或尼龍膜上，可做半定量分析優(yōu)點：簡單、快速、可同時檢測多個樣品一張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。DNA斑點雜交RNA斑點雜交完整細胞斑點雜交7778（1）DNA斑點雜交：①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。③用鉛筆在濾膜上標好位置,將DNA點樣于膜上,每個樣品一般點5μl(2~10μgDNA)。④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆?。?）RNA斑點雜交：與上法類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經酚/

氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5μlDEPC水，加5μl

甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然

后取5-8μl點樣于處理好的濾膜上，烘干。（3）完整細胞斑點雜交：應用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養(yǎng)物的特異序列進行快速檢測，將整個細胞點到膜上，經NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標本，因為它使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交，但它不適用于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產生高本底。794、菌落雜交

也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標記特異的DNA或RNA探針雜交。鑒定重組子。80檢測重組體克隆的菌落雜交技術81821）定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內原位雜交和組織切片內原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交83

保持組織細胞的形態(tài)對核酸無抽提、修飾與降解作用不改變核酸在組織細胞內的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對雜交信號無遮蔽作用理化性質穩(wěn)定2）雜交過程：（1）組織或細胞的固定理想固定液應具備：84（2）組織細胞雜交前的預處理

去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶

K去除核酸表面的蛋白質組織細胞內的核酸與蛋白質結合成核酸蛋白復合體控制消化時間，避免細胞結構破壞和核酸從載玻片上脫落85（3）探針的選擇與標記

以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針探針的長度一般為50~300bp,有時達1.5kb

放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定檢測結果分辨率高，但信號檢測時間長非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易于觀察86（4）雜交

雜交液體積?。?0~20μlcDNA和RNA探針雜交溫度約為50℃

雜交時間:DNA探針雜交為2~4h.RNA探針雜交過夜雜交前一般將組織切片置95℃5~15分鐘使DNA變性沖洗溫度一般不超過50℃87（5）雜交結果檢測

所用探針為核素標記,放射自顯影檢測所用探針為非核素標記,比色或化學發(fā)光檢測8889直接法熒光原位雜交原理89熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）905、蛋白質/DNA、蛋白質/RNA雜交技術911）凝膠阻滯實驗（Gelretardationassay）

又叫DNA遷移率變動實驗（DNAmobilityshiftassay），也稱作ElectrophoreticMobilityShiftAssay（EMSA），是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當前被選作分離純化特定DNA結合蛋白質的一種典型的實驗方法。原理：

DNA與蛋白的結合導致了電泳時遷移率的降低。92凝膠阻滯實驗的基本原理圖放射性標記的DNA由于同一種細胞蛋白質B結合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影****凝膠電泳放射性標記的DNA細胞蛋白質提取物蛋白質與DNA結合******BDNA-蛋白質結合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質結合93不僅可以用來鑒定在特殊類型細胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片段結合的蛋白質分子而且可以研究發(fā)生此種結合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標記競爭DNA）94(a)(b)(c)

在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用（a）沒有加入競爭DNA的正常的凝膠阻滯實驗，探針DNA與特異蛋白質結合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結合同一種蛋白質，阻滯條帶消失；（c）競爭DNA與探針DNA分別結合不同的蛋白質，出現(xiàn)同（a）一樣的阻滯條帶。**********蛋白質與未標記的競爭DNA結合凝膠電泳放射自顯影蛋白質與標記的探針DNA結合**********95

可以間接的闡明體內發(fā)生DNA與蛋白質之間的相互作用。

1.用具有已知轉錄因子結合位點的競爭DNA，可檢測蛋白是否屬于此類轉錄因子

2.在競爭DNA的已知轉錄因子結合位點上，引入突變可評估突變對競爭DNA性能及其轉錄因子結合的影響。96

凝膠阻滯實驗能揭示在體內發(fā)生的DNA與蛋白質之間的相互作用的有關信息，但無法確定兩者結合的準確部位。而DNaseⅠ足跡實驗可以解決這個問題972）DNaseⅠ足跡實驗（footprintingassay）是一類用于檢測與特定蛋白質結合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術。足跡實驗的一個明顯優(yōu)點是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質因子同特定DNA片段之間的結合區(qū)域。9832p1510*14810*加入蛋白質X加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影1510AB足跡(a)(c)(b)DNaseI足跡實驗99

如果使用較大的DNA片段，通過足跡實驗便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質因子之間的結合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實驗一樣，我們也可以加入非標記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據(jù)此測定其核苷酸序列的特異性。100硫酸二甲酯（DMS）足跡實驗：

DMS能使裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，六氫吡啶會對甲基化的G殘基作特異的化學切割。

而與蛋白結合的DNA片段上的G殘基，不會被DMS甲基化，從而避開了六氫吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在具這些G殘基末端的DNA片段，出現(xiàn)了空白區(qū)。101甲基化干擾實驗（methyltioninterferenceassay）根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設計出了另一種研究DNA與蛋白質相互作用的實驗方法，即甲基化干擾實驗。這種技術可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質結合作用究竟會有什么效應，從而更加詳細地揭示DNA與蛋白質之間相互作用的模式。DMS化學干擾的主要局限性是，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質相互作用的精確位置。具體操作如下頁圖所示。102GGGGGGmⅠGGGⅢmGGGmⅡGGGmⅡGGGmⅠGGGⅢmDNA局部甲基化與蛋白質提取物混合與蛋白質結合不與蛋白質結合與蛋白質結合凝膠電泳與蛋白質結合的DNA帶含有Ⅰ和Ⅲ兩種類型DNA片段不能與蛋白質結合的DNA帶含有全部三種類型DNA片段切除所有結合與不結合蛋白質的DNA帶，并用六氫吡啶切割甲基化的G殘基結合帶非結合帶缺失的DNA帶表明相應G殘基的重要意義，它得到結合蛋白質的保護甲基化干擾實驗1034、體內足跡實驗GG×GG×meGGGGMeMe完整的細胞裸露的DNADMS硫酸二甲酯分離DNA并用六氫吡啶切割凝膠分析PCR擴增受保護的G殘基應用甲基化保護作用進行的體內足跡實驗104105基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray106轉錄組學的研究方法－DNA芯片技術107基因芯片技術流程一、PCR技術原理二、PCR技術主要類型三、PCR技術主要應用第三節(jié)聚合酶鏈式反應108PolymeraseChainReaction聚合酶鏈式反應，即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬乃至千百萬倍。一、PCR技術原理109（一）PCR技術簡史DNA的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長110PCR技術簡史DNA的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物111PCR技術簡史DNA的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶112PCR技術簡史DNA的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明1971年，Khorana提出：經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設想被人們遺忘了……113PCR技術簡史DNA的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內的DNA復制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎114

PCR的發(fā)明人，一般公認是穆里斯（K.Mullis），他獲得了1993年的諾貝爾化學獎。穆里斯在許多作品中，包括1990年在《科學美國人》上的一篇文章，及1998年的自傳《心靈裸舞》（DancingNakedintheMindField），都曾提到PCR這個構想的起源。115“頓悟”

那是在1983年春天的一個周五晚上，他開車帶著女友前往鄉(xiāng)間的小屋度周末。在蜿蜒的鄉(xiāng)間公路上開著車，一段DNA反復復制的景像，在他的腦海里冒了出來。穆里斯原以為這樣簡單的想法，應該有人提出過，但搜索文獻后卻發(fā)現(xiàn)沒有。116PCR技術的發(fā)明PCR的發(fā)明是DNA操作技術的革命美國Mullis教授開汽車時的聯(lián)想

逶迤崎嶇的山路行駛的汽車

1988年發(fā)明了PCR技術

1993年獲諾貝爾獎117118KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年，Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。119國內復旦大學1988年起開始研制耐熱性多聚酶，軍事醫(yī)學科學院馬立人教授等在1989年研制成功了PCR自動裝置，并且不斷推陳出新，最近研制的PTC51A/B型DNA熱循環(huán)儀體積小，造型美觀，價格適宜，操作簡單，尤為適宜國內應用。120PCR發(fā)明不到10年，卻已獲得廣泛應用。目前，每年都有上千篇文章發(fā)表。1991年，期刊“PCR方法與應用”（PCrMethodsandApplication）在美國創(chuàng)刊，使有關學者有了自己的論壇和參考的專業(yè)期刊。PCR技術作為一種方法學革命，必將大大推動分子生物學各有關學科的研究，使其達到一個新的高度。1211993年度諾貝爾化學將已于10月13日揭曉，KaryMullis因發(fā)明了“聚合酶鏈式反應”而獲得此殊榮?，F(xiàn)在世界各地都在使用PCR檢測病人血液中的微量遺傳物質，這一成就為精確診斷艾滋病及其它病癥鋪平了道路。瑞典皇家科學院說：“PCR方法已經廣泛應用于生物醫(yī)學中。該方法同DNA測序法結合起來很可能將成為研究動植物分類學的一種革新工具?！币幻幽么蠹茖W家MichaelSmith因開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點誘變”的方法而與Mullis同享此榮。122引物引物Mullis的構思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段123Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402012472℃94℃55℃PCR循環(huán)125（二）PCR的基本原理類似于DNA的體內復制。首先將待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復。126127PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；128PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；129PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。130Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。131TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon132（三）PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點標準的PCR反應條件：10X緩沖液10μL4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/L133PCR儀134PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點1351234522557294時間（min）溫度（℃）PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍136模板DNA95℃137PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物138PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶139PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束第2輪開始140PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq141PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束142PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

143PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU（空斑形成單位）細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA144標準的PCR反應體系10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物(上、下游引物)10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙蒸水至100ul（四）PCR反應體系1451、PCR反應五要素（反應成分）引物（primers）酶（TaqDNApolymerase）

dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+

（magnesium）1461）引物理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈作引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增147引物設計的原則①引物長度：15-30bp，常用為20mer左右引物的有效長度不能大于38mer，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴增產物特異性②引物擴增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴增長至10kb片段③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列148引物設計的原則④避免引物內部出現(xiàn)二級結構避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異性擴增條帶⑤引物3’端的堿基要求嚴格配對特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處引物設計的原則⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：每條引物的濃度0.2~1umol，以最低引物量產生所需結果為佳引物濃度偏高會導致錯配和非特異性擴增，且又增加引物之間形成二聚體的機會150GenBank網(wǎng)址：

使用Blast程序，輸入引物序列，等待結果報告151引物設計網(wǎng)址/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi152DNAstarPrimerpremierSoftwareforprimerdesign依靠經驗直接設計1532）酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應天然酶：從嗜熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應約需酶量2.5U（指總反應體積為100ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少1543）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等

濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量

dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。1554）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。1565）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5-2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。1572、循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

95oC20-30秒(2)退火溫度由引物長度和GC含量決定。

增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性。158（3）延伸

70-75oC，延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加159PCR產物的積累規(guī)律在PCR反應中，DNA擴增過程遵循酶的催化動力學原理。反應初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴增。隨著目的DNA產物逐漸積累，在引物一模板與DNA聚合酶達到一定比例時，酶的催化反應趨于飽和，此時擴增DNA片段的增加減慢進入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應”，又稱“平臺期”。到達平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產物的競爭等因素。到達平臺期前，TaqDNA聚合酶一般要進行25次以上PCR循環(huán)。

多數(shù)情況下，平臺期在PCR反應中不可避免。160

PCR產物的積累規(guī)律示意圖161（五）PCR引物的設計一般原則①引物長度一般以18～30bp為宜，過短則降低特異性，過長則會引起引物間的退火而影響有效擴增，同時也增加引物合成的成本。②避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免序列內有較長的回文結構，使引物自身不能形成發(fā)夾結構。③G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。162④要避免兩個引物間特別是3`末端堿基序列互補以及同一引物自身3`末端堿基序列互補的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)卡結構。⑤引物3`末端堿基一般應與模板DNA嚴格配對，并且3`末端為G、C或T時引發(fā)效率較高。⑥引物5`末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關的序列(如限制性核酸內切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便于克隆和表達，但其保護堿基有一定的要求。⑦引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性。163（六）PCR中應注意的事項（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設立對照：陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板試劑對照：除模板外的所有組分164二、PCR技術主要類型165PCR技術的主要類型1、反向PCR

6、錨定PCR2、不對稱PCR7、原位PCR3、RT-PCR

8、重組PCR4、差異顯示PCR

9、免疫PCR5、實時定量PCR

10、多重PCR1661、反向PCR(reversePCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增?？蓪ξ粗蛄袛U增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列167已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶1682、不對稱PCR

目的：擴增產生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM，關鍵是限制性引物的絕對量。在PCR反應的最初10～15個循環(huán)中，其擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結構功能的研究169

高濃度引物低濃度引物1703、RT－PCR

反轉PCR（RT-PCR）是以反轉錄的cDNA作模板所進行的PCR反應，用于測定基因表達的強度和鑒定已轉錄序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性，克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及從非常少量的mRNA樣品構建大容量的cDNA文庫。171逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增172基因mRNA蛋白質多肽鏈173M01240124

C57DBAOPNβ-actin

1：0g/Kg乙醇

2：1g/Kg乙醇

3：2g/Kg乙醇

4：4g/Kg乙醇有文獻報道，在乙醇作用下骨橋蛋白表達上調可能是對肝的一種保護。C57BL/6和DBA/2兩種小鼠OPN的mRNA本地表達水平相當，在乙醇作用下，C57BL/6小鼠OPN的mRNA表達明顯上調，DBA/2小鼠OPN的mRNA表達沒有明顯變化，這可能和C57BL/6J比DBA/2耐受乙醇有關。1744、多重PCR（MultiplexPCR）多重PCR又稱多重引物PCR或復合PCR，在一個反應體系中使用一對以上引物的PCR稱為多重PCR。其結果是產生多個PCR產物，用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物1755、實時定量PCR技術原理實時定量PCR（也稱TaqManPCR,以下簡稱FQ-PCR）是美國PE（PerkinElmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術，該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針來實現(xiàn)其定量功能的，與變通PCR相比，F(xiàn)Q-PCR具有許多優(yōu)點。176實時定量PCR(real-timePCR):通過特定設計的PCR儀器來實時檢測PCR擴增過程每一輪循環(huán)產物的累積數(shù)量，可以很好的推算模板的起始濃度，這種工作方式稱為實時定量PCR。177實時熒光定量PCR:實時定量PCR在檢測過程中通過檢測標記的熒光信號的累積來實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，故稱為實時熒光定量PCR。178實時定量PCR具體實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。179實時定量PCR一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。實時熒光定量PCR技術中的一些重要因素：Ct值。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關系，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小?？衫脕碛嬎愠鲈摌悠返钠鹗伎截悢?shù)。

180實時熒光定量PCR中熒光化學，熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。181TaqMan熒光探針SYBR熒光染料182TaqMan熒光探針原理和方法

FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反應系統(tǒng)中加入一個熒光標記探針。該探針可與引物包含序列內的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5’端標以熒光發(fā)射基因FAM（熒光發(fā)射峰值在518nm處），靠近3’端標以熒光淬滅基團TAMRA（熒光發(fā)射峰值在582nm處），探針的3’端被磷酸化以防止探針在PCR擴增過程中被延伸。當探針保持完整時，淬滅基團抑制發(fā)射基團的熒光發(fā)射。發(fā)射基團一旦與淬滅基團發(fā)生分離，抑制作用被解除，518nm處的光密度增加而被熒光探測系統(tǒng)檢測到。復性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA模板移動，當移動到探針切斷,淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來。模板每復制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數(shù)目和PCR產物數(shù)量是一對一的關系,因此用該技術可對模板進行準確定量。183184

實時PCR技術原理185實驗儀器一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR擴增儀，也可用其它PCR儀。如果用ABI7700型反應型反應系統(tǒng)進行實驗，反應結束后,通過電腦分析,可直接給出定量結果。如果用其他PCR儀,則需要同時使用熒光探測儀測量反應管中的熒光信號,計算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管熒光發(fā)射基團發(fā)光強度與淬滅基團發(fā)光強度的比率,RQ-代表空白管中二者的比率,△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR過程中熒光信號變化量，經過數(shù)據(jù)處理，即可得出定量結果。186由于熒光探針的引入，顯著提高了實驗的特異性。探針設計一般應符合以下條件：①探針長度應在20～40個堿基左右，保證結合特異性。②GC堿基含量在40%～60%，避免單核苷酸序列的重復。③避免與引物發(fā)生雜交或重疊。④探針與模板結合穩(wěn)定程度要大于引物與模板結合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實驗結果有影響。187

特點

FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應用，可以通過光電傳導系統(tǒng)直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點。FQ-PCR只須在加樣時打開一次蓋子，其后的過程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了常規(guī)PCR操作中的諸多弊端。188實時熒光定量PCR應用（1）

病原體測定由于PCR技術的問世，使得病原體檢測能夠快速而方便的進行。但由于其高靈敏性，實驗操作很容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴增即可為陽性結果，但并不能作為診斷依據(jù)，只有當一定數(shù)量的病原體存在時才有臨床意義，因此模板定量顯得特別重要。常規(guī)PCR由于不能定量而限制了其應用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技術給解決這一問題提供了可能。目前該技術已經應用于丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測研究。Morris等用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進行了研究。FQ-PCR技術在保持巢式PCR高度敏感性的同時又能提高效率，因此可作為一種檢測HCV的有效方法。同時，由于FQ-PCR可以測出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)。189以前常規(guī)檢測大腸桿菌的方法，都因為繁瑣，需要大量的PCR后處理過程及不能對標本定量而受到限制。美國Witham等1996年將FQ-PCR技術應用于牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測研究。針對不同血清變異型的大腸桿菌，他們設計應用不同的探針，從而提高了實驗特異性。他們同時還對探針相對于引物的位置、反應液中探針濃度、鎂離子濃度等影響實驗的因素進行了優(yōu)化實驗，以提高實驗的準確性和精確性。由于TaqMan系統(tǒng)可以一次測量96管樣品，還可對模板進行準確定量，又不需要進行電泳及EB染色后處理過程，實際應用方便，從而提高了實驗的參考價值和應用價值。因此該實驗方法是食品檢測方面的一個突破。190（2)腫瘤研究

意大利Gelmini等用FQ-PCR技術檢測乳腺癌標本c-erbB-2基因拷貝數(shù)目變異情況。他們以β-肌動蛋白基因為參照探索最佳實驗條件，當擴增循環(huán)數(shù)在28～31之間時，△RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關系。他們在此條件下擴增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)△RQ都與各自的模板DNA濃度存在著線性關系，雖然二者斜率不同，但是各個實驗濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說明盡管二者發(fā)光效率不同，卻不影響定量效果。他們將實驗數(shù)據(jù)與Southern印跡結果和已報告的競爭性PCR結果比較都顯示高度相關性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。191(

3)基因表達研究

由于TaqMan系統(tǒng)及熒光探針的應用，對mRNA的檢測顯得較以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準確得多。為了探測骨髓基質血小板生成因子（TPO）在巨核細胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在特發(fā)性血小板減少性紫瘢（ITP）、再生障礙性貧血（AA）和特發(fā)性血小板多癥（ET）等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等用TaqManEZRT-PCR試劑盒在ABI7700反應系統(tǒng)測定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基質細胞TPOmRNA水平，又用ELISA方法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結果顯示ITP和AA病人TPOmRNA水平明顯升高，而ET病人的TPOmRNA水平則正常，經類固醇治療后ITP病人TPOmRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其mRNA水平有相關性；在正常人和ITP病人，TPOmRNA表達水平與巨核細胞計數(shù)也有相關性。這個實驗對闡明TPO的作用提供了依據(jù)。192(

4)免疫組份分析

對免疫T細胞群體V-β組份進行分析是研究健康和疾病免疫應答反應的重要手段，可通過流式細胞法或RFQ-PCR法來進行。1997年Lang等用FQ-PCR技術進行實驗，他們在反應系統(tǒng)中引入熒光探針，將下游引物與探針固定，然后，針對不同的V-β成份，選用特異的上游引物進行擴增，再對反應中產生的熒光信號進行處理，即可獲得各個成份的數(shù)據(jù)。193

(5)基因突變及多態(tài)性的研究

美國Ibrahim等1997年用FQ-PCR技術對正常痘病毒多態(tài)性進行了研究。他們采用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結合的引物，并設計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標記后進行實驗，順利地把有此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進行鑒定。該技術也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態(tài)的研究。194

(6)其他方面

日本Isono利用FQ-PCR進行葉綠體成熟度與其基因組拷