DB41河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標準主要起草人：陳曉、戴鋼、周新保、鄧士政、徐立新、滕開瓊1農(nóng)作物種子轉(zhuǎn)基因成分檢測方法要求、儀器和設(shè)備、樣品預(yù)處理、核酸提取與純化、定性PCR反應(yīng)凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T19495.4轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品農(nóng)業(yè)部869號公告-3轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Bt11及其衍生品種定性農(nóng)業(yè)部869號公告-4轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗除草劑油菜MS1、RF1及其衍生品種定性PCR農(nóng)業(yè)部869號公告-5轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗除草劑油菜MS8、RF3及其衍生品種定性PCR農(nóng)業(yè)部869號公告-6轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗除草劑油菜MS1、RF2及其衍生品種定性PCR轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米TC1507及其衍生品種定性農(nóng)業(yè)部869號公告-8轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種定性轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲玉米MON810及其衍生品轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲玉米MON863及其衍生品種定性轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗除草劑油菜GT73及其衍生品種轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑玉米GA21及其衍生品種農(nóng)業(yè)部869號公告-13轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑玉米NK603及其衍生品種定性PCR方法轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲玉米Bt10及其衍生品種定性PCR轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測抗病水稻第2部分:轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑油菜T45及其農(nóng)業(yè)部953號公告-4轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗除草劑油菜Oxy-235及其衍生品種定性轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑油菜Topas19/2及其衍生品種轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲水稻TT51-1及其衍生品種2農(nóng)業(yè)部1485號公告-1轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑棉花MON1445及其衍生品種定性PCR農(nóng)業(yè)部1485號公告-5轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗病水稻M12及其衍生品種定性PC農(nóng)業(yè)部1485號公告-6轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑大豆MON89788及其衍生品種定性農(nóng)業(yè)部1485號公告-7轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑大豆A2704-12及其衍生品種定性農(nóng)業(yè)部1485號公告-8轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑大豆A5547-127及其衍生品種定性農(nóng)業(yè)部1485號公告-9轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲耐除草劑玉米59122及其衍生品種定性農(nóng)業(yè)部1485號公告-10轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑棉花LLcotton25及其衍生品種定農(nóng)業(yè)部1485號公告-12轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑棉花MON88913及其衍生品種定性農(nóng)業(yè)部1485號公告-13轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲棉花MON15985及其衍生品種定性PCR方法農(nóng)業(yè)部1485號公告-14轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因棉花外源蛋白表達量檢測技農(nóng)業(yè)部1485號公告-15轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲耐除草劑玉米MON88017及其衍生品種農(nóng)業(yè)部1782號公告-1轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑大豆356043及其衍生品種定性PCR農(nóng)業(yè)部1782號公告-4轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測高油酸大豆305423及其衍生品種定性PCR方法農(nóng)業(yè)部1782號公告-5轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑大豆CV127及其衍生品種定性PCR方法農(nóng)業(yè)部1782號公告-10轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101構(gòu)建特異性農(nóng)業(yè)部1782號公告-11轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101及其衍生品批量篩查農(nóng)作物種子，定性檢測其是否含有轉(zhuǎn)基因成分的檢測方3火反應(yīng)、在合適溫度下結(jié)合在兩條單鏈上的引物通過核酸聚合酶作用進行PC一條可互補結(jié)合在模板核酸鏈上的短的單鏈，提供3'-OH末端作為核酸合成的起點，延伸合成模板46.1.1從送驗樣品中分取的試驗樣品應(yīng)具有代表性，并有足夠的6.1.3按照陰性、待測樣品、陽性對照順序提6.2.3檢測為陽性的樣品，可進一步根據(jù)轉(zhuǎn)化事件檢測方法，確認轉(zhuǎn)化事件。具體檢測7.4天平(量程分別為0.001g，0.017.5移液器(量程分別為20μL，200μL，17.11高速離心機（轉(zhuǎn)速≥6000r7.12移液器(量程分別為2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，10059核酸提取與純化9.1.1試劑9.1.1.7十二烷基磺酸鈉（C19.1.1.8異戊醇（C5H12O）。9.1.1.9氯化鈉(NaCl)。9.1.2溶液配制9.1.2.11mol/L三羥甲基氨基甲烷稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷溶解于約800mL水中，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至8.0，加水定容至至室溫，用1mol/L氫氧化鉀調(diào)pH至8.0，用水定容至1009.1.2.3提取/裂解緩沖液液，100mL乙二銨四乙酸二鉀溶液，用鹽酸或氫氧化鉀調(diào)pH至8.0，加水定容至1000在約800mL水中依次加入10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液，2mL乙二銨四乙酸二鉀溶液，用鹽酸或氫氧化鉀調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL9.1.2.6洗滌溶液69.1.3.1取30mg～80mg粉碎后的樣品置入1.5mL尖底離心管中，加入600μL裂解溶液，65oC水浴9.2.1試劑9.2.1.3苯酚：氯仿：異戊醇=25：24：1.9.2.1.8N-月桂酰肌氨酸鈉（C13H24NNaO3,SLS）9.2.2溶液配制9.2.2.11mol/L三羥甲基氨基甲烷稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷溶解于約800mL水中，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至8.0，加水定容至室溫，用1mol/L氫氧化鉀調(diào)pH至8.0，用水定容至19.2.2.3提取/裂解緩沖液在約600mL水中加入20gN-月桂酰肌氨酸鈉（SLS），充分溶解后，加入50mL三羥甲基氨基甲烷-9.2.2.4洗滌溶液79.3試劑盒法制備核酸。經(jīng)實驗室確認的核酸提取純化試劑盒，按照其使用說9.4核酸的濃度和質(zhì)量9.4.1核酸樣品應(yīng)經(jīng)質(zhì)量檢測并調(diào)整濃度。9.4.3核酸終濃度調(diào)整為40ng/μL～159.5核酸溶液的保存9.5.1陰性和陽性對照核酸溶液應(yīng)分裝，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。zSSIIb5′-TCGATTTCTCTCTTGGTWX0128SPSLectin5′-GCCCATCTGCAAGCCTTSadI5′-TTGAGGTGAGTCAGAATGTTHMGI/YCaMv35SNOSBARCp4-epspsbt√√ √√√——√√——√√√—√—√√ √√√√√√ CaMV35S5′-GCTCCTACAAATGCCATCcp4-epspsbarbtnos9反應(yīng)體系見表4。 程序一:55℃~65℃15s～30s35Cycles11.2根據(jù)檢測結(jié)果，具備下列條件，能確定未檢測到目MON810MON810MON863NK603MON88017MIR604MS1M12MON89788A2704A5547-127MON531MON1445MON88913檢測報告格式No.