單元四：血栓與止血檢驗及其應用項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)目錄項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗1.掌握：常用纖溶物質(zhì)檢驗（3P試驗、t-PA、FDP和D-二聚體）原理、注意事項及臨床意義。2.熟悉：纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物的作用。3.了解：纖溶系統(tǒng)的組成及基本理論。4.具備常用纖溶物質(zhì)的檢測能力。5.學會分析纖溶物質(zhì)檢驗結(jié)果。學習目標項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)纖維蛋白溶解系統(tǒng)：簡稱纖溶系統(tǒng)。其主要作用是將沉積在血管內(nèi)外的纖維蛋白溶解，起到修復、祛除和防止血管內(nèi)由于纖維蛋白沉著(如血栓形成)引起的阻塞作用。纖溶系統(tǒng)功能亢進可引起出血，功能減低則可導致血栓形成，因而纖溶系統(tǒng)具有重要的生理和病理意義。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)（一）纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)組成1．纖溶酶原激活物（1）組織纖溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,t-PA)（2）尿激酶樣纖溶酶原激活物(urokinase-likeplasminogenactivator,u-PA)項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)（一）纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)組成2．纖溶酶原(plasminogen,PLG)和纖溶酶(plasmin,PL)PLG由肝合成的一種單鏈糖蛋白，以無纖溶活性的酶原形式存在于血液中。纖溶酶原在其激活物t-PA或u-PA作用下轉(zhuǎn)變成有纖溶活性的雙鏈結(jié)構(gòu)絲氨酸蛋白水解酶，它除了能裂解纖維蛋白原和纖維蛋白外，還參與分解凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ和因子Ⅻa等。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)（一）纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)組成3.纖溶抑制物（1）纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogenactivatorinhibitor,PAI）能特異性抑制t-PA和u-PA激活纖溶酶原，主要有二種：①纖溶酶原抑制物-1(PAI-1)，其作用是和t-PA或u-PA形成復合物使其失活。PAI-1也可抑制凝血酶、因子Ⅸa、Ⅻa、激肽釋放酶和APC的活性。②纖溶酶原抑制物-2(PAI-2)，對t-PA的抑制作用較PAI-1弱。正常人血漿中無PAI-2，但在妊娠早期開始出現(xiàn)，隨著妊娠而增高，產(chǎn)后迅速減少或消失。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)（一）纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)組成3.纖溶抑制物（2）纖溶酶抑制物：正常血漿中有很多非特異性纖溶酶抑制物，最重要且與纖溶酶形成1:1復合物（PAP）使其失去蛋白水解活性的特異性抑制物是α2抗纖溶酶（α2-antiplasmin，α2-AP）。α2-AP是一種肝合成的單鏈糖蛋白，血漿濃度為50mg/L。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

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一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)（一）纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)組成3.纖溶抑制物（3）凝血酶激活的纖溶抑制物（TAFI）：TAFI是一種血漿蛋白質(zhì)，以酶原的形式存在，血漿濃度約為75nM，被凝血酶-TM復合物激活后，形成具有蛋白水解活性的TAFI（TAFIa，即羧基肽酶），TAFIa通過抑制PLG激活、抑制纖溶酶的纖溶活性和水解纖溶蛋白的羧基端賴氨酸而抑制纖溶酶。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)（二）纖維蛋白（原）溶解機制1．纖溶酶原激活途徑項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)（二）纖維蛋白（原）溶解機制2．纖維蛋白（原）降解機制（1）纖維蛋白原的降解：（2）可溶性纖維蛋白的降解：（3）交聯(lián)纖維蛋白的降解：項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

一、纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)（三）纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物的作用

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二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（一）優(yōu)球蛋白溶解時間測定（二）血漿組織纖溶酶原激活物測定（三）血漿組織纖溶酶原激活物抑制物測定（四）血漿纖溶酶原活性測定（五）血漿a2-抗纖溶酶活性測定（六）血漿硫酸魚精蛋白副凝固試驗（七）血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物的檢測（八）血漿D-二聚體測定項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（一）優(yōu)球蛋白溶解時間測定【實驗原理】血漿優(yōu)球蛋白組分中含纖維蛋白原、纖溶酶原和纖溶酶原激活物等，但不含纖溶酶抑制物。用低離子強度和Ph4.5的溶液沉淀和分離優(yōu)球蛋白，再溶于緩沖液中，加鈣或凝血酶使其凝固，測定凝塊完全溶解的時間，即優(yōu)球蛋白溶解時間。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（一）優(yōu)球蛋白溶解時間測定【試劑】(1)0.109mol/L枸櫞酸鈉。(2)0.025mol/L氯化鈣溶液（或2U/ml凝血酶溶液）。(3)1%醋酸溶液。(4)硼酸鹽溶pH9.0:氯化鈉9g、硼酸鈉1g、蒸餾水加至1000ml。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（一）優(yōu)球蛋白溶解時間測定【操作】(1)快速分離枸櫞酸抗凝血漿。(2)取尖底離心管1支，加蒸餾水7.5ml和1%醋酸溶液0.12ml，使pH為4.5，置冰浴中。(3)取血漿0.5ml加到上述離心管中，混勻，繼續(xù)置冰浴中10min,使優(yōu)球蛋白充分析出。

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二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（一）優(yōu)球蛋白溶解時間測定【操作】(4)以3000r/min離心5min，傾去上清液，倒置離心管于濾紙上，吸去殘余液體，沉淀即為優(yōu)球蛋白。(5)加硼酸鹽緩沖液0.5ml于沉淀中，37℃水浴，輕輕攪拌使沉淀溶解。(6)加0.025mol/L氯化鈣溶液（或2U/ml凝血酶溶液）0.5ml，凝固時開始計時。置37℃水浴中觀察凝塊完全溶解不見絮狀物為止，所需時間即為ELT。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（一）優(yōu)球蛋白溶解時間測定【參考區(qū)間】加鈣法:129min48s±4min6s加凝血酶法：（123±24）min項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（一）優(yōu)球蛋白溶解時間測定【臨床意義】(1)ELT縮短（<70min）表明纖溶活性增強，見于原發(fā)性和繼發(fā)性（DIC）纖溶亢進。但在DIC早期尚未發(fā)生繼發(fā)性纖溶亢進是，或當纖溶極度亢進，纖溶酶絕大部分已被消化時，可為陰性。(2)ELT延長表明纖溶活性減低，見于血栓形成前期和血栓形成性疾病。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（二）血漿組織纖溶酶原激活物測定【實驗原理】根據(jù)雙抗體夾心法原理，將純化的組織纖溶酶原激活物（t-PA）單克隆抗體包被在反應板上，加入待測樣本和標準品，加過氧化物酶標記的t-PA抗體，再加鄰苯二胺（OPD）顯色后讀取A值，計算出其血漿濃度。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（二）血漿組織纖溶酶原激活物測定【試劑】(1)t-PAELISA法試劑盒(2)洗滌液0.025mol/L氯化鈣-聚山梨醇。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（二）血漿組織纖溶酶原激活物測定【操作】(1)常規(guī)采血，分離PPP。(2)試劑盒要求將待測血漿和標準品加入包被好的反應板孔內(nèi)，37℃溫育1h后，洗滌甩干。(3)加過氧化物酶標記抗體，37℃溫育1h后洗滌甩干，立即加OPD顯色(避光)。(4)顯色20min(室溫)，以4mol/L硫酸終止反應，在波長492nm的酶標儀上讀取A值。(5)制成直線回歸方程，并計算出t-PA的樣本濃度。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（二）血漿組織纖溶酶原激活物測定【參考區(qū)間】t-PA：1～12μg/L項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（二）血漿組織纖溶酶原激活物測定【臨床意義】(1)t-PA增高見于應激反應、劇烈運動、先天性增高以及纖溶亢進時。(2)減低往往見于高凝狀態(tài)和血栓性疾病、口服避孕藥、肥胖癥等。PAI增高見于血栓性疾病和高凝狀態(tài)，減低見于原發(fā)性或繼發(fā)性纖溶癥。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（三）血漿組織纖溶酶原激活物抑制物測定【實驗原理】根據(jù)雙抗體夾心法原理，將純化的纖溶酶原激活物抑制物（PAI）單克隆抗體包被在反應板上，加入待測樣本和標準品，加過氧化物酶標記的PAI抗體，再加鄰苯二胺（OPD）顯色后讀取A值，計算其血漿濃度。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（三）血漿組織纖溶酶原激活物抑制物測定【試劑】(1)PAIELISA法試劑盒。(2)洗滌液0.025mol/L氯化鈣-聚山梨醇。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（三）血漿組織纖溶酶原激活物抑制物測定【操作】(1)常規(guī)采血，分離PPP。(2)試劑盒要求將待測血漿和標準品加入包被好的反應板孔內(nèi)，37℃溫育1h后，洗滌甩干。(3)加過氧化物酶標記抗體，37℃溫育1h后洗滌甩干，立即加OPD顯色(避光)。(4)顯色20min(室溫)，以4mol/L硫酸終止反應，在波長492nm的酶標儀上讀取A值。(5)制成直線回歸方程，并計算出PAI的樣本濃度。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（三）血漿組織纖溶酶原激活物抑制物測定【參考區(qū)間】PAI:2～10μg/L項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（三）血漿組織纖溶酶原激活物抑制物測定【臨床意義】(1)PAI增高見于血栓性疾病和高凝狀態(tài)。(2)減低見于原發(fā)性或繼發(fā)性纖溶癥。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（四）血漿纖溶酶原活性測定【實驗原理】免疫擴散法：受檢血漿（含抗原）加到含抗纖溶酶原（PLG）血清的瓊脂糖擴散板中，自然擴散一定時間后，測定抗原抗體反應沉淀弧的直徑計算受檢者血漿PLG抗原的含量，其直徑與PLG含量呈正相關。發(fā)色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶（SK)和發(fā)色底物（S-2251)，PLG在SK的作用下轉(zhuǎn)變成PL，后者作用于發(fā)色底物，釋放出對硝基苯胺（PNA）而顯色。顏色的深淺與纖溶酶的水平呈正相關，通過計算求得血漿中PLG的活性。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（四）血漿纖溶酶原活性測定【試劑】--免疫擴散法(1)抗人纖溶酶原血清和標準血漿。(2)pH8.2巴比妥緩沖液。(3)瓊脂糖。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（四）血漿纖溶酶原活性測定【操作】--免疫擴散法(1)常規(guī)采血，分離PPP。(2)制備免疫擴散板以巴比妥緩沖液配制的2%瓊脂糖溶液與等量抗血清混合后制成寧攪拌。用打孔器在板上以間距15mm等距打孔，孔徑3mm。(3)將標準血漿用巴比妥緩沖液作1﹕2、1﹕4、1﹕8、1﹕16稀釋，待測血漿作1﹕2稀釋，加入反應板加樣孔中（10μl/孔）。(4)置37℃溫箱24h，精確測量沉淀弧直徑，制成直線回歸方程，并計算出待測樣本的濃度。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（四）血漿纖溶酶原活性測定【參考區(qū)間】--免疫擴散法PLG:230～340mg/L項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（四）血漿纖溶酶原活性測定【臨床意義】(1)血漿纖溶酶原含量減低可見于先天性纖溶酶原缺乏癥，但更常見于纖溶酶原激活物活性增強的情況，如原發(fā)性和繼發(fā)性纖溶亢進、溶栓治療后、重癥肝炎、肝硬化、肝葉切除術、大手術后、腫瘤播散、嚴重感染等。(2)纖溶酶原含量增多往往反應纖溶活性的降低，如高凝狀態(tài)和血栓性疾病。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（五）血漿a2-抗纖溶酶活性測定【實驗原理】在待測標本中加入過量的纖溶酶，纖溶酶與標本中的a2-AP結(jié)合形成復合物，剩余的纖恪酶水解發(fā)色底物S2251，使底物釋放出對硝基苯肢(PNA)，生色的深淺與α2-AP活性成反比。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（五）血漿a2-抗纖溶酶活性測定【試劑】(1)纖溶酶。(2)發(fā)色底物S2251。(3)標準血漿(20個以上的正常人混合血漿)。(4)2mol/L的硫酸終止液。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（五）血漿a2-抗纖溶酶活性測定【操作】(1)將標準血漿稀釋10倍，設此時α2-AP活性為200%，按表1加入到酶標板上。(2)將待測標本用緩沖液作20倍稀釋，取100μl加入到酶標板中，37℃保溫10min。(3)將發(fā)色底物及纖溶酶分別用1ml緩沖液溶解，37℃保溫30min。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（五）血漿a2-抗纖溶酶活性測定【操作】(4)吸取50μl纖溶酶加入到待測標本中，37℃準確保溫2min。(5)吸取50μl發(fā)色底物加至上述孔中，混勻，置室溫1min左右。加終止液20μI，檢測405nm吸光度。(6)以405nm吸光度為縱坐標，以α2-AP:A為橫坐標，繪制標準曲線。(7)以待測標本的405nm吸光度值在標準曲線上查出α2-AP:A，再乘以稀釋倍數(shù)就得到待測血漿的α2-AP:A。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（五）血漿a2-抗纖溶酶活性測定【參考區(qū)間】α2-AP:A:95.6±12.8%項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（五）血漿a2-抗纖溶酶活性測定【臨床意義】（1）α2-AP:A增高見于靜脈、動脈血栓形成、惡性腫瘤、分娩后等。（2）α2-AP:A減低見于肝病、DIC、手術后、先天性α2-AP缺乏癥等。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（六）血漿硫酸魚精蛋白副凝固試驗【實驗原理】纖維蛋白原在凝血酶作用下釋放出A肽和B肽后轉(zhuǎn)變成纖維蛋白單體(FM)。FM具有自行聚合呈肉眼可見的纖維、絮狀或膠凍裝的特性。如發(fā)生繼發(fā)性纖溶，存在纖維蛋白降解產(chǎn)物，尤其X’片段可和FM形成可溶性復合物，而硫酸魚精蛋白具有分離這種復合物的能力，可使FM游離出來，形成肉眼可見的纖維素樣物質(zhì)，稱為血漿魚精蛋白副凝固試驗,也稱3P試驗。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（六）血漿硫酸魚精蛋白副凝固試驗【試劑】(1)0.109mol/L枸櫞酸鈉。(2)1%硫酸魚精蛋白溶液。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（六）血漿硫酸魚精蛋白副凝固試驗【操作】(1)常規(guī)采血，分離PPP。(2)取0.5mlPPP置37℃水浴3min。(3)加入0.05ml(1/10血漿量)的1%硫酸魚精蛋白溶液，置37℃水浴15min，立刻觀察結(jié)果。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（六）血漿硫酸魚精蛋白副凝固試驗【參考區(qū)間】陰性項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（六）血漿硫酸魚精蛋白副凝固試驗【臨床意義】陽性見于DIC早期、中期、嚴重創(chuàng)傷，大手術，咯血、嘔血以及久置冰箱的樣品。DIC晚期和原發(fā)性纖溶表現(xiàn)為陰性，故在區(qū)別原發(fā)性和繼發(fā)性纖溶時有一定意義。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（七）血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物的檢測【實驗原理】膠乳凝集試驗（Fi試驗）：用特異性抗纖維蛋白（原）D、E片段抗體標記的膠乳顆粒與受檢血清混合，如血清中含有FDP，特別是D、E片段，可發(fā)生抗原抗體反應，導致膠乳顆粒凝集。膠乳增強散射比濁法：將FDP抗體包被在膠乳顆粒上，與FDP結(jié)合后，形成FDP抗原抗體復合物的膠乳凝集顆粒，體積增大，根據(jù)散射光的變化計算出其含量。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（七）血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物的檢測【實驗原理】ELISA法：將抗FDP抗體（多克隆或單克隆抗體）包被于固相載體上（酶標反應板），加入待測血清或尿液。如存在FDP即發(fā)生抗原抗體反應，形成的復合物再與酶聯(lián)抗體（過氧化物酶標記的相同抗體）反應，以OPD顯色，讀取的A值與FDP含量呈正比，參照用標準品制成的標準曲線可算出待測樣品的FDP量。項目二十二：纖維蛋白（原）溶解系統(tǒng)及檢驗

二、纖維蛋白溶解系統(tǒng)檢驗（七）血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物的檢測【參考區(qū)間】膠乳凝集法陰性；散