DB21DB21/T2534—2015鹿流行性出血病病毒熒光PCR檢測方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofepizootichaemorrhagicdiseaseofdeer遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicATranscriptionPolymeraseChainReacti采用TaqMan方法，比對鹿流行性出血病病毒基因組S基因的核苷酸序列，設(shè)計特異性引物和特異性的熒光雙標記探針進行配對。探針5'端標記FAM熒光素為報告熒光基團（用R表因發(fā)出的熒光信號。PCR反應(yīng)進入退火階段時，引物和探針同時與目的基因片段結(jié)合，此時的熒光不再為Q所吸收而被檢測儀所接收。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進行，PCR產(chǎn)物與熒光信號的5試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級5.1試劑5.1.20.01mol/LPBS（見附錄A.5.1.4三氯甲烷。5.1.6異丙醇（-20℃預(yù)冷）。（pH8.3見附錄A.5）,2.5mmol/LMgCl2（見附錄A.6）?？刹捎玫刃唐坊噭?.1.8dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)。5.1.9引物：合成一對特異性引物：上游引物5'-GCGTTGGATATATTGGACAAA5.2儀器與耗材5.2.4混勻器。5.2.7微量可調(diào)移液器。5.2.8離心管。5.2.10離心管5.2.11微量帶芯吸嘴（10μL6生物安全要求研磨后凍融3次，離心，取上清液，-24℃10000g離心15min。將水相轉(zhuǎn)移到新管中，加離心5s，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進行RT-PCR擴增或放置于-7），將7.3.1中離心后的PCR管放入實時熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)參數(shù)設(shè)8結(jié)果判定8.2.3如陰性對照和陽性對照條件不滿足以上條件，此實驗視無Ct值并且無擴增曲線，表明樣品中無鹿流行性出Ct值≤30，且出現(xiàn)特定的擴增曲線，表示樣品中存在鹿流行性出血去離子水按0.1%加入DEPC，37℃靜置過夜，采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高壓滅菌后稱取17g氯化鈉，用適量蒸餾水溶解，量取13mLA液和87mLB液，混合，用蒸餾水定容至2L。采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高壓A.375％乙醇溶液量取75ml無水乙醇溶液，加入雙蒸水中，充分混勻，定容至100A.450mmol/L氯化鉀（50mmol/LKCl）稱取3.73g氯化鉀，加入雙蒸水，充分