DB37DB37/T2031—2012奶牛DNA親子鑒定技術(shù)規(guī)程TechnicalSpecificationforDNAParentageIdentificationinDairyCattle2012-02-09發(fā)布2012-03-01實(shí)施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1NY/T1672-2008綿羊多胎主效基因FecB分子SN/T1917-2007牛地方流行性白2又稱(chēng)多重引物PCR或復(fù)合PCR，是指在同一PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出利用常染色體微衛(wèi)星分型技術(shù)，選取不同染色體上的微衛(wèi)星位點(diǎn)，采用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682的雙蒸水；高壓滅菌3從細(xì)管中取出精液放入1.5mL離心管中，然后，加入500μL生理鹽水，混勻，12000rpm離棄除上清液，保留底部的白色沉淀。重復(fù)上述步驟一次。加入精子DNA抽提液400μL及5μL蛋白酶K，旋小心吸取上清液，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中，加入150μL酚和150μL氯仿，輕加入400μL雙蒸水，充分溶解，4℃或-20℃產(chǎn)物擴(kuò)增分4次PCR反應(yīng)完成。同一擴(kuò)增組合的引物加入同一PCR反應(yīng)管中。25μL反應(yīng)體系：10×Buffer2.5μL、50mmol/LMg組合)各1.0μL、待測(cè)個(gè)體模板DNA（或者陽(yáng)性對(duì)照DNA）100ng、加雙蒸水至反應(yīng)總體積為25μL。PCR擴(kuò)7.6.3將混合液緩慢倒入制膠板中，排除氣泡，插入多齒梳子。待凝4PCR產(chǎn)物、去離子甲酰胺和TAMRA內(nèi)標(biāo)按0.5μL:lOμL:O.5μL比例混合，95℃變性5min，ABIPRISM3100儀器測(cè)序，ABIPRISM3100DATACOLLECTION軟件分析微衛(wèi)星的基因型。FAM、HEX和TAMR注：1-TGLA53、INRA023位點(diǎn)兩重PILSTS006位點(diǎn)三重PCR產(chǎn)物；CSRM60、BM1824、ETH10所示，根據(jù)相對(duì)熒光強(qiáng)度和片段大小，可獲得待測(cè)個(gè)體不同STR標(biāo)記的基因型。不同親緣關(guān)系的個(gè)其微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因大小不同，表現(xiàn)出不同的基因型。陽(yáng)性對(duì)照樣品12個(gè)STR標(biāo)記不同等位基因的根據(jù)待檢個(gè)體STR標(biāo)記的基因型，利用Cervux3.0軟件分別計(jì)算其親子指數(shù)的LOD值。當(dāng)LOD＞05主要試劑配制8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶A.40.5mol/LNaCl（將121.1gTris溶于800mLA.9TE緩沖液6取1mol/LTris.HCl（p1mol/LTris.HCl(pH=在10mL水中加入100mg的溴化乙錠（EB溶解后分裝成A.142%的瓊脂糖7主要儀器設(shè)備2μL，10μL，20μL，100μL，8使用溫度范圍45-135℃,最高使用壓力0.255Mpa。溫控范圍50-300℃,箱內(nèi)尺寸350mm×350mm×450mm。9記1AAGATGTGATCCAAGAGAGAGAGGACCAGATCGTGAAAGGCA15AAAGTGACACAACAGCTTCTCAACGAGTGTCCTAGTTTGGCT22973ACAGACAGAAACTCAATGAAAAATCACATGGCAAATAAGTACA4ATCTTCACATGATATTACAGC3TAACTACAGGGTGTTAGATCSRM60(98，100)BMBM1824(182，184)ETH10（215,221）SPS115（245,245）TGLA227（92,105）TGLA227（92,105）BMBM2113(124,134)ILSTS006（288,288）ETH225（14