熒光定量PCR技術特點、原理及其應用-23應用

由于FQ-PCR具有高靈敏性，高特異性和高精確性的特點，目前，該項技術已被應用于病原體測定、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因表達、突變及其多態(tài)性的研究等多個領域。

3.1病原體測定

由于PCR技術的問世，使得病原體檢測能夠快速而方便的進行。但由于其高靈敏性，實驗操作很容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴增即可為陽性結果，但并不能作為診斷依據，只有當一定數(shù)量的病原體存在時才有臨床意義，因此結模板定量顯得特別重要。常規(guī)PCR由于不能定量而限制了其應用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技術給解決這一問題提供了可能。目前該技術已經應用于丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測研究。Morris等[3]用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進行了研究。測定顯示，可測得的樣品濃度相當于每毫升13個基因組。與巢式PCR比較顯示，F(xiàn)Q-PCR有著與巢式PCR相同的敏感性。另外，還對48例臨床丙型肝炎病人血清樣品進行了測試，32例樣品兩種檢測方法均為陽性，10例均為陰性；另有6例用兩種方法測定的結果不一致。該6例樣品又讓第三個實驗室用巢式PCR方法重新測定，其結果與FQ-PCR測定的結果一致率為100%。FQ-PCR技術在保持巢式PCR高度敏感性的同時又能提高效率，因此可作為一種檢測HCV的有效方法。同時，由于FQ-PCR可以測出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供參考依據。

與宮頸癌及其癌前病變有關的人類乳頭瘤病毒（HPV）有多種類型，以HPV-16、18、31、33、35等類型危險性最高。Swan等[4]1997年用FQ-PCR技術對子宮陰道灌洗標本進行了研究。

他們發(fā)現(xiàn)，由于熒光探針的應用，對各型HPV的檢測變得十分方便和準確。由于HPV-16的特異引物可以和HPV-66的模板DNA發(fā)生錯配，用一般PCR方法擴增時，如有HPV-66存在，即可擴增出HPV-66片段而發(fā)生誤診，但是HPV-16特異探針的應用使HPV-66在TaqMan系統(tǒng)中不能擴增。因此，F(xiàn)Q-PCR對不同亞型的病毒檢測具有高度特異性。同時也發(fā)現(xiàn)FQ-PCR具有高度敏感性，用一般PCR方法檢測不到的HPV模板濃度在TaqMan系統(tǒng)中卻可檢測到。對于HPV-16、18、31、33、35類型敏感高達到每100～1000個細胞中含有一個拷貝的HPV基因組，平均每300個細胞中含有一個拷貝的HPV基因組。

以前常規(guī)檢測大腸桿菌的方法，都是采用多種選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)分離法，對產志賀氏毒素的大腸桿菌（SLTEC）缺乏特異性，因此這種菌株的檢測又費時又困難。后來又有應用抗體的免疫學方法和核酸序列測定的生化方法及以DNA擴增為基礎的PCR方法等，都因為繁瑣，需要大量的PCR后處理過程及不能對標本定量而受到限制。美國Witham等[5]1996年將FQ-PCR技術應用于牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測研究。針對不同血清變異型的大腸桿菌，他們設計應用不同的探針，從而提高了實驗特異性。他們同時還對探針相對于引物的位置、反應液中探針濃度、鎂離子濃度等影響實驗的因素進行了優(yōu)化實驗，以提高實驗的準確性和精確性。由于TaqMan系統(tǒng)可以一次測量96管樣品，還可對模板進行準確定量，又不需要進行電滬及EB染色后處理過程，實際應用方便，從而提高了實驗的參考價值和應用價值。因此該實驗方法是食品檢測方面的一個突破。此外，加拿大Chen等[6]1997年也把FQ-PCR技術用于食品中沙門氏桿菌的檢測研究。

在抗癆治療開始后，結核病人痰中可持續(xù)存在有結核桿菌，為了研究結核病人痰標本DNA定量結果是否與有活力的結核桿菌數(shù)量相符合并監(jiān)測治療反應，1998年美國Desardin等[7]用FQ-PCR和競爭性PCR兩種方法定量檢測治療期間連續(xù)收集的結核病人痰標本，結果顯示兩種方法有較好的重復性和準確性。痰中結核桿菌DNA定量結果與抗酸染色顯微鏡下計數(shù)的結果一致。

3.2腫瘤研究

意大利Gelmini等[2]用FQ-PCR技術檢測乳腺癌標本c-erbB-2基因拷貝數(shù)目變異情況。他們以β-肌動蛋白基因為參照探索最佳實驗條件，當擴增循環(huán)數(shù)在28～31之間時，△RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關系。他們在此條件下擴增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)△RQ都與各自的模板DNA濃度存在著線性關系，雖然二者斜率不同，但是各個實驗濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說明盡管二者發(fā)光效率不同，卻不影響定量效果。為了檢驗FQ-PCR的準確性和對不同基因拷貝數(shù)的分辨率，他們將c-erbB-2基因的DNA樣本用正常胎盤DNA做不同倍數(shù)稀釋后進行實驗，測得的結果與期望值高度相關（r=0.997）。他們將實驗數(shù)據與Southern印跡結果和已報告的競爭性PCR結果比較都顯示高度相關性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。

1998年法國Bieche等[8]用FQ-PCR測定了108例乳腺癌標本。他們選擇擴增頻率較高的myc、ccnd1和erbB2基因進行擴增，在108例標本中，發(fā)現(xiàn)10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷貝數(shù)增加，拷貝數(shù)增加的最大值分別為4.6、18.6、15.1。同時他們又將這些數(shù)據與Southern印跡的結果進行比較，顯示了較好的相關性。

3.3基因表達研究

由于TaqMan系統(tǒng)及熒光探針的應用，對mRNA的檢測顯得較以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準確得多。為了探測骨髓基質血小板生成因子（TPO）在巨核細胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在特發(fā)性血小板減少性紫瘢（ITP）、再生障礙性貧血（AA）和特發(fā)性血小板多癥（ET）等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等[9]用TaqManEZRT-PCR試劑盒在ABI7700反應系統(tǒng)測定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基質細胞TPOmRNA水平，又用ELISA方法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結果顯示ITP和AA病人TPOmRNA水平明顯升高，而ET病人的TPOmRNA水平則正常，經類固醇治療后ITP病人TPOmRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其mRNA水平有相關性；在正常人和ITP病人，TPOmRNA表達水平與巨核細胞計數(shù)也有相關性。這個實驗對闡明TPO的作用提供了依據。日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技術對鼠成肌細胞系C2C12中肌肉調節(jié)因子的表達水平及動態(tài)變化進行了研究。

3.4免疫組份分析

對免疫T細胞群體V-β組份進行分析是研究健康和疾病免疫應答反應的重要手段，可通過流式細胞法或RFQ-PCR法來進行[11，12]。流式細胞法是通過對細胞群體進行直接而方便的V-β表達方面的研究，但需要一整套單克隆抗體和大量細胞來進行染色分析，而且人類V-β特異性抗體尚不完備，因此該方法有許多不便之處。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量細胞，引物設計也很方便，而且已有多種定量方法，包括錨式PCR法、半定量PCR法、競爭性PCR法等[13，14]，但都因PCR產物的后處理過程需凝膠電泳、EB染色和光密度測量等既費時，又降低了準確性，還增加了污染機會，使得FQ-PCR的應用受到限制。1997年Lang等[15]用FQ-PCR技術進行實驗，從而避免了這些問題，他們在反應系統(tǒng)中引入熒光探針，將下游引物與探針固定，然后，針對不同的V-β成份，選用特異的上游引物進行擴增，再對反應中產生的熒光信號進行處理，即可獲得各個成份的數(shù)據。

3.5基因突變及多態(tài)性的研究

美國Ibrahim等[16]1997用FQ-PCR技術對正常痘病毒多態(tài)性進行了研究。他們采用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結合的引物，并設計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標記后進行實驗，順利地把有此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進行鑒定。該技術也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態(tài)的研究。

3.6其他方面

日本Isono[17]利用FQ-PCR進行葉綠體成熟度與其基因組拷貝數(shù)關系的研究。他們以核基因Cab作為內參照，進行葉綠體基因rbc1拷貝數(shù)測定，結果發(fā)現(xiàn)子葉出現(xiàn)以后，葉綠體基因拷貝數(shù)顯著增加，進而把葉綠體的基因拷貝數(shù)增加與光誘導的葉綠體成熟過程聯(lián)系起來。1998年美國Higgins等