導師XX教授

研究生XX五、預期目標六、已具備條件和個人條件七、前期工作基礎（可行性）八、研究工作的主要階段、進度和完成時間九、經(jīng)費預算十、實驗風險及前景分析

三立論依據(jù)和國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.脊髓損傷嚴重威脅人們的健康和生活質(zhì)量，被視為臨床治療的難題。脊髓損傷后的修復一直是神經(jīng)科學研究領域的一大難題。近年來神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)及其相關研究為脊髓損傷的治療提供了一種新的策略。2.膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中除神經(jīng)元外的另一類細胞成分。數(shù)量上膠質(zhì)細胞遠多于神經(jīng)元，有報道CNS內(nèi)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的數(shù)目之比為10：1～50：1。星形膠質(zhì)細胞約占正常成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞總數(shù)的40％。星形膠質(zhì)細胞在中樞的作用不僅僅是保護、營養(yǎng)和支持，還參與血－腦屏障的構成、水的轉運、遞質(zhì)的代謝和釋放、離子平衡的維持等[6~8](VanDcGraaff,1998;SulyoklE,2004;朱長庚.神經(jīng)解剖學)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）是構成神經(jīng)膠質(zhì)細胞的主要細胞骨架蛋白，其表達的高低可以反映膠質(zhì)細胞的功能狀態(tài)[9](BiginiP,2001)?；罨男切文z質(zhì)細胞內(nèi)GFAP的增高，可能起保護神經(jīng)元的作用，星形膠質(zhì)細胞在損傷區(qū)分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，以促進中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)軸索的生長和存活[10](JCdelaTorre,2002)。很多研究表明PCD存在于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的多個環(huán)節(jié)[11](NaruseI,1995)，從未分化的神經(jīng)上皮到遷移后的有絲分裂后細胞，從神經(jīng)管的形成[12](李澤桂,1999)到神經(jīng)元與靶區(qū)的匹配都有PCD發(fā)生，凡不能與靶區(qū)正確匹配和參與正常神經(jīng)網(wǎng)絡形成的神經(jīng)元均通過PCD加以清除[13](HommaS,1994)。

配制方法：封閉用正常血清原液可用PBS或TBS稀釋成5-10%（即1：10-1：20倍稀釋）后使用。3％H2O2

廠家：天津市化學試劑三廠批號：050905

配制方法：30%H2O250ml

+

蒸餾水450mlNestin、NeuN、GFAP抗體

Nestin：Chemicon公司（批號MAB5326)

NeuN：Chemicon公司（批號MAB377）

GFAP：Upstate公司（批號07－650）－20

℃冰箱保存，稀釋后4℃保存PV－9000免疫組化試劑盒

廠家：中杉公司

Lot:509102-8℃保存DAB顯色液（ZLI-9032）批號：13861842-8℃保存PBS緩沖液檸檬酸鹽修復液TUNEL－POD試劑盒廠家：Roch公司批號：4.2儀器或設備：(1)高壓鍋:廠家：潮安縣順發(fā)五金制品有限公司批號：xk16-203-00048(2)顯微鏡:廠家：Olympus

批號：XS-212-201(3)LX-100手掌型離心機廠家：江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠(4)HT-200微量電子天平廠家：成都善瑞遜電子有限公司(5)LX-100手掌型離心機廠家：江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠3.實驗詳細步驟（1）取材（2）固定（3）制作石蠟切片Ⅰ放入包埋盒中已固定好的組織用自來水沖洗24小時（為了把甲醛除去）；Ⅱ脫水；Ⅲ透明；Ⅳ浸蠟；Ⅴ切片：切成5μm厚的切片；Ⅵ貼片：載玻片經(jīng)過防脫片處理。Nestin、NeuN、GFAP免疫組化步驟：1.石蠟切片進行常規(guī)脫蠟、水化：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→無水乙醇10min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min→蒸餾水Ⅰ3-5min→蒸餾水Ⅱ3-5min。2.抗原修復：（1）高溫高壓抗原修復：取適量的檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）于壓力鍋中（緩沖液的量必須能足夠浸沒整個切片）放置于電磁爐上加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫染色架上，放入已沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，扣閥至噴汽以4-6min為佳。時間到，壓力鍋離開熱源。稍置數(shù)分鐘后，用自來水沖淋使之冷卻，去閥開蓋，室溫放置20min。自然冷卻后取出切片。（2）微波抗原修復取適量檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）于燒杯中放入微波爐里加熱至沸騰，將脫蠟

后置于耐高溫切片架上的切片放入沸騰的檸檬酸緩沖液中繼續(xù)加熱10min即可，取出燒杯，室溫中通風處放置20～30min。自然冷卻后取出切片。3.用0.01MPBS沖洗2-3min→3%H2O2去離子水浸泡10min（以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性）→PBS沖洗3次，每次5min。4.5％羊血清室溫下封閉30分鐘。5.甩去羊血清，不洗，直接在切片組織上滴加適量稀釋的抗體（Nestin、NeuN、GFAP一抗），置于4℃冰箱過夜。切片置于濕盒中。6.次日上午把切片從冰箱中取出，先在室溫中放置30min（以使切片適應室溫）。7.0.01MPBS沖洗3次，每次5min。除去PBS（用力甩去）。每張切片上加一滴試劑1（中杉公司的免疫組化試劑盒PV-9000），室溫下孵育20min。8.0.01MPBS沖洗3次，每次5min。除去PBS。切片上滴加試劑2（PV-9000），室溫下孵育30min。細胞凋亡原位檢測的步驟：采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒1.石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。2.新鮮配制3%H2O2，室溫處理15min。0.01M

PBS液洗滌5min×3次。3.切片上滴加消化液（10mMTris-Hcl

995ul加入1mg/mlProteinaseK新鮮稀釋至5ug/ml）,37℃消化20min，0.01MPBS洗5min×3次。4.新鮮配制通透液，4℃孵育20min或室溫孵育8min。0.01MPBS洗5min×3次。

通透液：取20XSSC20ul，TritionX-1004ul（45℃-50℃預熱），加單蒸水3.98ml，定容至100ml，充分均勻。5.標記甩去切片上多余液體，標本片擦干組織及周邊水分，按每張切片滴加1液和2液（1：9，混合均勻）配成TUNEL反應混和液（冰上操作）。陰性對照組只加入試劑2液，而不加1液。標本上覆蓋塑料蓋片，置樣品于濕盒中，37℃標記1h，后4℃過夜。（20h以上）。0.01M

PBS洗5min×3次。6.滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫中30min，甩掉封閉液，不洗。

7.轉化劑—POD50μl/片滴加至標本片上。置樣品于濕盒中，37℃孵育40min.0.01MPBS洗5min×3次。8.DAB顯色，室溫5-10min。單蒸水中止顯色，流水沖洗10min。9.脫水，透明，封片。八研究工作的主要階段、進度和完成時間1.實驗所需標本已制作完成2.2007.11－2008.1開始做預實驗及正式實驗3.2008.1－2008.4觀察結果，圖像分析統(tǒng)計，撰寫論文九經(jīng)費預算1.nestin、NeuN、GFAP三個抗體價格Anti-NeuN：3437.50元（chemicon公司）Anti-nestin：3000元（chemicon公司）Anti-GFAP：3737.50元（Upstate公司）2.免疫組化試劑盒第二代通用型二步法檢測系統(tǒng)（北京中杉公司，PV-9000）320.00元/3.0ml3.細胞凋亡原位檢測試劑盒（TUNEL）

Roche公司4600元4.封閉用正常羊血清（原液）（北京中杉公司，ZLI－9020）45元/10ml2.實驗結果與預期不符這就要求我們從標本固定取材開始直至后續(xù)的免疫組化染色和原位凋亡細胞的檢測都嚴格操作，不忽視每一個環(huán)節(jié)、每一個步驟。試劑準備充分，實驗設計合理，實驗操作熟練、準確，努力將實驗風險控制到最小程度。[5]ConradAM,JeanH,JoanWB.Analysisofthetemporalexpressionofnestininhumanfetalbrainderivedneuronalandglialprogenitorcells[J].DevelopmentalBrainResearch,2002,134(1－2):87-92.[6]VanDcGraaff,KentM.Humatnanatomy.UnitedStatesofAmerica;TheMcGrawHillCompanies,1998.340-345.[7]SulyoklE,VajdaZ,DocziT,etal.Aquaporinsandthecentralnervoussystem.ActaNeurochir,2004,146(9):955-960.[8]朱長庚.神經(jīng)解剖學.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.400-407,1033-1046.

[9]BiginiP,BastoneA,MenniniT.Glutamatetransportersinthespinalcordofthewobblermouse[J].Neuroreport，2001.12(9):1815.[10]JCdelaTorre.Alzheimer‘sdisease:howdoesitstart?

JAlzheimersDis，2002,4（6）:497～512.[11]NaruseI,KeinoH.ApoptosisindevelopingCNS.ProgressinNeurobiology，1995,47(2):135～155[12]李澤桂，蔡文琴，陳活彝.神經(jīng)管發(fā)生與程序性細胞死亡.解剖科學進展，1999,5(3)