在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛

優(yōu)點：1.直接觀察活細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動。用于細胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實驗醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等多種學(xué)科研究.2.直接觀察細胞的變化可便于攝影。3.研究細胞種類如低等到高等到人類、胚胎到成體、正常組織到腫瘤。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛

細胞培養(yǎng)技術(shù)4.便于使用各種技術(shù)：相差、熒光、電鏡、組化、同位素標(biāo)記等方法觀察和研究細胞狀況。5.是分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的研究對象，也是其主要的組成部分。6.易于施用物理、化學(xué)生物的實驗研究。7.易于提供大量生物性狀相似的實驗對象,耗資少比較經(jīng)濟。8.成為生物制品單克隆抗體生產(chǎn)和基因工程等的材料來源。細胞培養(yǎng)技術(shù)缺點：組織和細胞離體后獨立生存在人工的培養(yǎng)環(huán)境中，雖然模擬體內(nèi)環(huán)境，仍有很大差異。因而利用培養(yǎng)細胞做實驗時，不應(yīng)視為體內(nèi)細胞完全相同，把實驗結(jié)果推測體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論。細胞培養(yǎng)技術(shù)七.細胞生存環(huán)境、條件和代謝

培養(yǎng)細胞生存途徑和物質(zhì)代謝與體內(nèi)細胞基本相同，隨生存環(huán)境改變出現(xiàn)一定差異。（一）環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證培養(yǎng)細胞生存的首要條件。保證細胞生存環(huán)境無任何污染、代謝物及時清除，是維持細胞生存的基本條件。

細胞培養(yǎng)技術(shù)

(二)溫度：人哺乳動物：36.5℃±0.5℃;鳥類：38.5℃;

一般培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力比高溫強溫度上升不超過39℃時,細胞代謝強度與溫度成正比。39～40℃1小時,受損傷的細胞可能恢復(fù)；41～42℃1小時,嚴重損傷,個別細胞恢復(fù)；43℃以上1小時，細胞全部死亡。細胞培養(yǎng)技術(shù)溫度不低于0℃時,細胞代謝有影響,無傷害作用;置于25～35℃，細胞能生存，但生長速度減慢；放在4℃數(shù)小時,再放回37℃細胞仍繼續(xù)生長。細胞代謝隨溫度降低而緩慢，溫度降至冰點以下時,細胞因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。細胞培養(yǎng)技術(shù)

(三)氣體環(huán)境和氫離子濃度氣體：氧氣和二氧化碳

氧氣:參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。氧氣分壓1995～89975Pa,適用于封閉式單層細胞培養(yǎng);開放式培養(yǎng)(碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng))細胞置于95％空氣加5％二氧化碳混合氣體環(huán)境中。

細胞培養(yǎng)技術(shù)

CO2:

細胞代謝產(chǎn)物,也是細胞所需成分。其主要作用維持培養(yǎng)基的pH值。大多數(shù)細胞的適宜pH7.2~7.4，偏離此范圍對細胞將產(chǎn)生有害的影響。有些細胞存在差異。如羊水細胞培養(yǎng)檢測染色體時pH為7.6。細胞培養(yǎng)技術(shù)

細胞耐酸比耐堿性大一些,在偏酸性環(huán)境中更有利于細胞生長。為了維持培養(yǎng)液恒定的pH，最常用磷酸緩沖劑方法。磷酸緩沖劑中NaHco3,可供給CO2但容易逸出，適用：封閉式培養(yǎng)的細胞。（無CO2培養(yǎng)箱）細胞培養(yǎng)技術(shù)

Hanks平衡液:

含有低濃度的NaHCO3,當(dāng)打開含有Hank液培養(yǎng)瓶時，CO2迅速逸出而導(dǎo)致酚紅指示劑變紅，表明培養(yǎng)液pH變堿，細胞在堿性的環(huán)境中時間過長可使細胞堿中毒。

細胞培養(yǎng)技術(shù)

羥乙基哌嗪乙硫磺酸(N`-2-HydroxyethylPiperazine-N`-EthanesulfonicAcid縮寫HEPES)HEPES：

對細胞無毒性也不起緩沖作用，主要作用是：防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細胞觀察時能維持恒定的pH。細胞生存所需基本物質(zhì)細胞培養(yǎng)技術(shù)（四）細胞生存所需基本物質(zhì)

與體內(nèi)基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂類三大類營養(yǎng)物質(zhì)外，一定量的無機鹽、維生素和微量元素等，但需要的量以及代謝方式與體內(nèi)細胞不盡相同。細胞培養(yǎng)技術(shù)糖：六碳糖是主要的能源通過糖酵解形成乳酸和通過檸檬酸形成CO2。胚胎細胞和一些轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)基中常見到乳酸堆積現(xiàn)象。細胞培養(yǎng)技術(shù)糖是合成某些氨基酸的原料；經(jīng)過乙酰輔酶A（CoA）合成脂肪；經(jīng)過糖解磷酸通路能合成核酸。各種糖的吸收取決于它們進入細胞的能力,其中葡萄糖最強,半乳糖最低。細胞培養(yǎng)技術(shù)2.

氨基酸：

12種氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、異亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)是細胞蛋白質(zhì)合成的原料。

細胞培養(yǎng)技術(shù)

所有細胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用,可促進各種氨基酸進入細胞膜。所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的來源；是合成3，2和一磷酸腺苷時所需物;是能源和碳的來源。如沒有谷胺酰胺細胞生長不良而發(fā)生細胞死亡。所以要求各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷胺酰胺。細胞培養(yǎng)技術(shù)

谷胺酰胺在溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)放置在－20℃冰箱保存，用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含有谷胺酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱內(nèi)可放置兩周以上時重新加入原來量的谷胺酰胺。細胞培養(yǎng)技術(shù)

需要維生素、生物素、葉酸、胭酰胺、核黃素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。這些維生素在常用培養(yǎng)基中已成為固定組成分。脂溶性維生素對細胞生長也有作用,一般從血清中得到補充。細胞培養(yǎng)技術(shù)

3.促生長因子：培養(yǎng)液除營養(yǎng)成分外，也需要激素類物質(zhì)起到促進細胞增殖生長作用。胰島素(1~10單位)促進細胞利用葡萄糖和氨基酸；氫化可的松(10-8~10-7M)促進表皮上皮細胞和乳腺上皮細胞增殖生長的作用，提高神經(jīng)膠質(zhì)細胞和成纖維細胞的克隆形成率；細胞培養(yǎng)技術(shù)

雌激素和雄激素，或使用黃體酮和氫化可的松對乳腺上皮細胞培養(yǎng)效果則更好。血清是提供生長因子和其細胞所需物質(zhì)的來源。目前血清、各種組織和其它生物成分用生物工程的方法提取并商品化。

細胞培養(yǎng)技術(shù)

4.

其它物質(zhì)：

在細胞生長過程中,需要鉀、鈉、鈣、鎂氮和磷以外，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒銅、錳、鉬釩等。需要促細胞粘附物質(zhì)其作用是：有助于促細胞貼附在各種底物或支持物上組織生長。細胞培養(yǎng)技術(shù)

5.人工培養(yǎng)基：

細胞在體外的生存環(huán)境是人工模擬的，除注意到無菌、溫度、空氣等條件外，最主要的是培養(yǎng)基，是供給細胞營養(yǎng)和保證細胞生長組織的物質(zhì)。培養(yǎng)基的種類分為半固體和液體培養(yǎng)基兩類。

液體培養(yǎng)基：分為合成、天然和無血清培養(yǎng)基三種。

細胞培養(yǎng)技術(shù)A．合成培養(yǎng)基：成分清楚,通過調(diào)節(jié)各種成分的數(shù)量和種類,再借觀察細胞生物狀況反應(yīng)性變化,測定細胞與外界環(huán)境的適應(yīng)能力。借以了解細胞生存條件,誘導(dǎo)細胞進行定向分化的等。

合成培養(yǎng)基在應(yīng)用上廣泛。細胞培養(yǎng)技術(shù)B．天然培養(yǎng)基：

用人或動物血清、血漿和胎汁等。常用牛血清。血清含有多種促生長因子、貼附因子及其它活性物質(zhì)等。加入5％血清：維持細胞不死或緩慢生長；加入10％～20％血清：細胞增殖生長。細胞培養(yǎng)技術(shù)血清的主要作用提供細胞生存、生長和增殖所必需的生長調(diào)節(jié)因子。補充培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。含有生長基質(zhì)成分使細胞易貼附在培養(yǎng)器皿上。提供載體蛋白，可結(jié)合維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。有中和毒性物質(zhì)保護細胞不受傷害。提供蛋白酶抑制劑，保護細胞不受死細胞釋放的蛋白酶的損害。細胞培養(yǎng)技術(shù)血清存在的問題存在有害于細胞生長和繁殖的物質(zhì)。如補體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子。成分不明確，影響對結(jié)果的分析。不同動物、不同批次的血清和活性差別較大，使培養(yǎng)的結(jié)果不穩(wěn)定。細胞培養(yǎng)技術(shù)C.無血清培養(yǎng)基：培養(yǎng)基內(nèi)加入促細胞生長因子，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)各種促細胞生長因子已達幾十種。還有三碘甲狀腺素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及大鼠頜下腺粗提物。具有促進細胞生長增殖的作用。細胞培養(yǎng)技術(shù)

6.附著底物:

除少數(shù)懸浮型細胞外,絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細胞需附著在適宜的底物上生長。不同細胞對底物要求不同，底物不適對細胞生長不良。細胞培養(yǎng)技術(shù)常用的底物：

A.玻璃：如用NaOH處理，性質(zhì)能受到一定影響;酸中和以后再用（新的鹽酸泡）易碎。B.一次性塑料：聚苯乙烯:多為一次使用。聚四氟乙烯包括：

細胞培養(yǎng)技術(shù)充電荷：親水性，適用單層培養(yǎng)不充電荷：疏水性，適用巨噬細胞、轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)。聚四氟乙烯透氣性好可制成薄膜，剪成小塊后放入各種瓶皿中，適于細胞貼附生長，也便于取出，可進行染色和做電鏡切片。細胞培養(yǎng)技術(shù)C.微載體：由聚苯乙烯和聚丙烯酰氨混和制成小球體，附著面大，利于大量繁殖細胞。細胞培養(yǎng)技術(shù)D:飼細胞(Feedercells)：也稱為滋養(yǎng)細胞，用成纖維細胞或其它細胞長成單層后，用大劑量射線照射，使細胞失去增殖能力，但能存活和有代謝活動。將其作為底物，其它細胞接種上面；飼細胞的代謝產(chǎn)物也有利于其它細胞生長。飼細胞用于：特殊難培養(yǎng)細胞，注意避免用同源細胞。細胞培養(yǎng)技術(shù)7.抑制細胞生長因素1.培養(yǎng)液消毒

2.操作不慎使有毒物質(zhì)混在細胞生存的環(huán)境中，抑制細胞生長。3.血清滅活處理可除去補體和降低免疫球蛋白的毒性,并不損傷多肽生長因子，但可能消滅另一些更有用的營養(yǎng)成分，因此有人提出，滅活血清不一定比不滅活血清更好。細胞培養(yǎng)技術(shù)第二節(jié)

細胞培養(yǎng)

正常細胞

腫瘤細胞

細胞培養(yǎng)技術(shù)正常細胞培養(yǎng)

人或動物體外培養(yǎng)都不易，建立細胞系更難。原因：是分化細胞；生存條件嚴格；目前沒有模擬與體內(nèi)完全一樣的方法；只要一切條件適當(dāng)時仍有培養(yǎng)成功的可能；初代比傳代容易。細胞培養(yǎng)技術(shù)體外培養(yǎng)的上皮組織基本特點

來源：外、內(nèi)、中三個胚層。特征：細胞排列密集，易形成膜狀呈貼壁性生長。細胞常相互黏附，具有生長的接觸性抑制現(xiàn)象。

上皮組織細胞的結(jié)構(gòu)和功能同樣表現(xiàn)出極性。細胞的增殖和分化依賴于促細胞生長因子的作用。上皮細胞的特殊結(jié)構(gòu)，如微絨毛、緊密連接、橋粒等，在培養(yǎng)細胞中也可見到。

細胞培養(yǎng)技術(shù)

上皮組織的細胞培養(yǎng)條件要求比較高，常需生長在特殊的生長基質(zhì)，極易失去在體內(nèi)巳有的分化特征，如細胞極性等。注意：不僅保證上皮細胞在體外的生長和繁殖；而且應(yīng)盡可能地恢復(fù)和誘導(dǎo)上皮細胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)下的分化。這也是上皮組織體外培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵。

細胞培養(yǎng)技術(shù)上皮細胞體外培養(yǎng)的特殊條件

(1)防范微生物污染：根據(jù)上皮組織分布的特性，位于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的上皮組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸，組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機會較多。細胞培養(yǎng)技術(shù)要求在組織取材時就嚴格滅菌；分離、種植、培養(yǎng)等諸多操作步驟上都要設(shè)法消除可能會出現(xiàn)的微生物污染。培養(yǎng)中所使用的各種液體，包括細胞保存液、分離液以及培養(yǎng)基等需添加抗生素，抗生素濃度比其它組織培養(yǎng)高。

細胞培養(yǎng)技術(shù)(2)生長基質(zhì)的支持：上皮細胞依賴貼附于某種支持物上才能生長，即所謂的貼壁依賴性細胞。在培養(yǎng)器皿表面包被生長基質(zhì)，如膠原或其它細胞外基質(zhì)成分等，模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)，不僅特別有利于上皮細胞的貼附和生長，也有利于培養(yǎng)細胞的分化．使細胞極性表現(xiàn)更為明顯。細胞培養(yǎng)技術(shù)(3)特殊的培養(yǎng)基：培養(yǎng)基有M199、RPMl1640、DMEM和HamFl2。其中以M199和RPMl1640較為常用。M199和RPMI1640培養(yǎng)基僅適用于上皮組織的短期培養(yǎng)和維持其生存，對上皮組織的長期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。M199和RPMl1640細胞培養(yǎng)技術(shù)DMEM和HamFl2培養(yǎng)基用于上皮組織培養(yǎng)時有其特殊作用。可促進上皮細胞的貼附；維持上皮細胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。DMEM和HamFl2細胞培養(yǎng)技術(shù)特別適用原代上皮細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分中添加微量元素的無機離子，更加利于細胞的生長和代謝。在實際培養(yǎng)時，將DMEM與HamFl2按一定比例混合用于上皮組織培養(yǎng)。加入血清，但出廠血清成分復(fù)雜，含有一定量的有毒物和抑制物。HamFl2培養(yǎng)基的特殊性細胞培養(yǎng)技術(shù)無血清培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中主要添加了各種促細胞生長因子，甚至還添加大鼠頜下腺或腦垂體的粗提物；以促進細胞的生長和增殖。無血清培養(yǎng)基對細胞也有良好的促生長作用，但仍需完善和改進。無血清培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)技術(shù)(4)去除成纖維細胞：上皮組織借薄層基膜和結(jié)締組織相連。取材分離細胞時會帶入少量結(jié)締組織成分，常常造成成纖維細胞與上皮細胞混和生長。由于成纖維細胞具有增殖能力和粘附能力強的特點，很容易“瘋長”為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢細胞群，從而干擾或抑制上皮細胞的生長，成為上皮細胞的“細胞污染源”。

成纖維細胞>上皮細胞細胞培養(yǎng)技術(shù)

因在上皮細胞的取材、分離、、種植和傳代的培養(yǎng)過程中，要特別注意上皮細胞的純化，去除和抑制成纖維細胞的生長。

細胞培養(yǎng)技術(shù)內(nèi)皮細胞：來源：人臍帶臍靜脈，動物動脈消化：用膠原酶比胰蛋白酶消化好。但要注意掌握消化時間和雜細胞（成纖維細胞和平滑肌細胞）。細胞培養(yǎng)技術(shù)

如消化時間過長或操作不慎、刮取過重時，會造成血管內(nèi)皮下層與外膜成纖維細胞以及中膜平滑肌細胞污染。由于這些雜細胞生長較快，隨著傳代次數(shù)越多，其污染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗。介紹排除雜細胞的方法：細胞培養(yǎng)技術(shù)①傳代時加酶液后，鏡下觀察1--2mln可見大部分內(nèi)皮細胞收縮變圓，而