ICS65.020.20

B16

備案號(hào)：60524-2018DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3487—2018

黃瓜綠斑駁花葉病毒苗期檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

TechnicalSpecificationfortheSeedlingDetectionofCucumberGreenMottle

MosaicVirus

2018-11-09發(fā)布2018-11-30實(shí)施

江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DB32/T3487—2018

黃瓜綠斑駁花葉病毒苗期檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了苗床期瓜苗黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測(cè)條件、檢測(cè)技術(shù)、結(jié)果判定和結(jié)果記載。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于苗床期癥狀尚未表現(xiàn)的瓜類作物上黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的的修改單）適用于本文件。

GB/T35335黃瓜綠斑駁花葉病毒病監(jiān)測(cè)規(guī)范

SN/T2964植物病毒檢測(cè)規(guī)范

3檢測(cè)條件

3.1主要試劑

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鉀（KCl）、氫氧化鈉（NaOH）、碳酸氫二

鈉（Na2HCO3）、氯化鈉（NaCl）、疊氮化鈉（NaN3）、PVP-400、雞卵清蛋白、無水亞硫酸鈉（Na2SO3）、

吐溫-20、焦碳酸二乙酯（DEPC）、溴百里酚藍(lán)、乙二醇、Tris堿、Tris-HCl、硼酸、EDTA、無水乙醇、

瓊脂糖、DIGDNALabelingKit、CGMMV抗體。PCR試劑和檢測(cè)過程中所需溶液配方，參見附錄A。

除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純或生化試劑。

3.2用具及儀器

用具耗材：移液器、一次性手套、牛皮紙袋、標(biāo)簽紙、記號(hào)筆等

儀器設(shè)備：高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)（規(guī)格：-6℃~20℃、最高轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分以上）、

電泳儀（規(guī)格：電壓50~120V、電流10~800mA）、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、超純水儀。

4檢測(cè)技術(shù)

4.1采樣方法

4.1.1采樣時(shí)間

待檢材料為嫁接或未嫁接的黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等瓜類作物幼苗，采樣時(shí)間為出廠定植前3

天~7天植株處于2片~4片真葉期。

4.1.2采樣部位

植株最上部半展開-展開的心葉，心葉未達(dá)要求時(shí)取位于心葉下部一張完全展開葉。

4.1.3取樣方法

五點(diǎn)法取樣，一株為一個(gè)樣本，不同品種或同一品種不同時(shí)間播種的為不同批次，每批次樣本數(shù)量

不小于200株或同批次苗的0.1%。樣本采集時(shí)使用一次性手套單株采集并臨時(shí)保存在一次性手套中。

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4.1.4樣品處置

取樣后葉片一分為二，一半為檢測(cè)樣品、一半為留存樣品。樣品用吸水紙包裹置于透氣牛皮紙袋中，

新鮮檢測(cè)樣品在4℃下臨時(shí)保存3天內(nèi)檢測(cè)完畢，如不能在3天內(nèi)檢測(cè)則將樣品于-20℃的條件下冰凍

保存。留存樣品室溫下蔭干-20℃的條件下冰凍保存一年后，確認(rèn)不再需要時(shí)焚燒或深埋處置。

4.2檢測(cè)方法

4.2.1樣品處理

稱取0.1g待檢樣品葉片，加入適量液氮充分研磨成粉末后加入10倍體積的通用樣品處理緩沖液（見

附錄A）溶解，10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，上清即為樣品提取液。同一批樣品中加入具典型斑駁花葉癥狀

并經(jīng)PCR法鑒定確認(rèn)為CGMMV的病樣稀釋1000倍為陽性對(duì)照、經(jīng)PCR法確認(rèn)無CGMMV的健康

葉片為陰性對(duì)照。

4.2.2免疫捕獲

4.2.2.1用碳酸鹽包被緩沖液（見附錄A）稀釋黃瓜綠斑駁花葉病毒的抗血清500倍，取稀釋后的抗血

清30μL包被PCR管，4℃孵育過夜或37℃下放置2h。

4.2.2.2棄包被緩沖液，用洗滌緩沖液（見附錄A）洗滌3次~4次，加入50μL樣品提取液，37℃孵育

2h。

4.2.2.3棄樣品提取液，用洗滌緩沖液洗滌3次~4次，再用無菌去離子水洗一次，吸盡管底余液后直接

在包被了病毒的PCR管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

4.2.3反轉(zhuǎn)錄

4.2.3.1CGMMV特異性引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)CGMMV分離物（Genbank序列號(hào)DQ217778）序列

設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增CGMMV-cp基因的特異性引物：F:5′-ATGGCTTACAATCCGATCAC-3′；R:5′-

TGGGCCCCTACCCGGGGAAAAG-3′，-20℃保存。

4.2.3.2反轉(zhuǎn)錄體系及操作在免疫捕獲后的CR管中加入CGMMV3’端引物1μL，DEPC水9μL，

65℃變性5min，取出置于冰上5min，再依次加入下列試劑：5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2μL，40

mmol/LdNTPs（每種10mmol/L）0.5μL，RNasin（40U/μL）0.5μL，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（20U/μL）

0.5μL，42℃水浴1h，70℃滅活10min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

管，參照NY/T2288-2012中7.4的要求進(jìn)行，并略有改進(jìn)。

具體操作參見附錄B。

4.2.4PCR

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系25μL。

25μLPCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：10×TaqPCRBuffer(WithMg2+)2.5μL，40mmol/LdNTPs（每種10

mmol/L）0.5μL，TaqDNAPolymerase(5u/ul)0.5μL，CGMMV上游引物（10μmol/L）0.5μL，CGMMV

下游引物（10μmol/L）0.5μL，cDNA3μL和DEPC水17.5μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，53℃退火50s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；

72℃延伸10min。

上述PCR結(jié)束后，每個(gè)PCR管中取出1μL加入新PCR管中，采用同樣的25μLPCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體

系和PCR反應(yīng)程序再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

5結(jié)果判定

7.1電泳檢測(cè)

配制1%瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物3μL與上樣緩沖液3μL混合加入樣品孔中，100V電泳30分鐘。

核酸染料染色15min，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

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7.2結(jié)果判定

觀察瓊脂糖凝膠電泳（參見附錄B）結(jié)果，陽性對(duì)照在660bp處有條帶出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無條帶

出現(xiàn)的前提下，待測(cè)樣品在660bp處有條帶出現(xiàn)，即可判定樣品攜帶CGMMV；否則為陰性反應(yīng)，即

樣品不攜帶CGMMV。

當(dāng)樣品檢測(cè)為陽性時(shí)，按GB/T35335規(guī)定執(zhí)行。

8結(jié)果記載

將實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定結(jié)果記載于表1（瓜苗攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒檢測(cè)結(jié)果記錄表）（見附錄B），

記錄保存1年以上。

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附錄A

(資料性附錄)

試劑及配制方法

A.1免疫捕獲緩沖液

A.1.1洗滌緩沖液（WashBuffer,0.01MPBST)

稱取8gNaCl、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、3gNa2HPO4溶化于800mL無菌去離子水中，再加入

0.5mLTween-20定溶于1000mL，即為0.01MPBST，4℃保存。

A.1.2通用樣品處理緩沖液（GeneralExtractBuffer）

稱取2g雞卵清蛋白，1.3g無水亞硫酸鈉，20gPVP-400和0.2g疊氮化鈉，加入1000mLA.1.1

所述0.01MPBST中，再加入10mLTween-20，4℃保存。

A.1.3碳酸鹽包被緩沖液（Coatingbuffer,0.5M)

稱取1.59g無水Na2CO3和2.93gNaHCO3，加水定容至1000mL，用HCl調(diào)節(jié)pH值至9.6，4℃保存。

A.2RT-PCR試劑

A.2.1RT-PCR分子試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP、購自大連寶生物公司。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、RNA酶抑制劑購自Promega

公司，-70℃保存。

A.2.2電泳緩沖液TBE

在1000mL去離子水中加入Tris堿54g、硼酸27.5g、20mL0.5MEDTA（pH8.0），使用時(shí)利用去

離子水10倍稀釋，即為0.5×TBE。

A.2.3瓊脂糖凝膠

在0.5×TBE工作液中加入1%(w/v)的瓊脂糖，融化，冷卻至60℃倒入插入梳子的制膠槽中，冷卻

凝固后點(diǎn)樣電泳。

A.2.4上樣緩沖液

取溴百里酚藍(lán)0.025g，乙二醇3g，加10mL蒸餾水。

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附錄B

(資料性附錄)

檢測(cè)結(jié)果記載表

表1瓜苗攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒檢測(cè)結(jié)果記錄表

第一次PCR結(jié)果第二次PCR結(jié)果

樣品采集樣品采集樣品種類測(cè)定樣品

陽性樣品陰性樣品帶毒株率陽性樣品陰性樣品帶毒株率鑒定技術(shù)負(fù)責(zé)人

日期地點(diǎn)與名稱數(shù)量（株）

數(shù)（株）數(shù)（株）(%)數(shù)（株）數(shù)（株）(%)