“升級版”雜交瘤篩選平臺任為抗體開發(fā)首席科學(xué)家北京義翹神州科技股份有限公司-如何加速抗體藥物發(fā)現(xiàn)01雜交瘤技術(shù)平臺及限制因素CONTENTS02主克隆提基因優(yōu)勢和案例04公司介紹03雜交瘤測序問題分析和優(yōu)化雜交瘤技術(shù)平臺及限制因素4YYYYYYYYYYYYYYYYYSplenocytesMyelomaHybridomacellsScreeningAmplification&purification雜交瘤抗體開發(fā)技術(shù)技術(shù)路線成熟，成本優(yōu)勢；電融合技術(shù)大幅提升融合效率；上清介入多功能篩選，提高成功率；自主開發(fā)鼠單抗數(shù)量>26000種700+技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)5雜交瘤案例——IHC診斷原料抗體開發(fā)小腸（20×）十二指腸（20×）結(jié)腸（20×）陽性組織（部分?jǐn)?shù)據(jù)展示）陰性組織（部分?jǐn)?shù)據(jù)展示）平滑肌（20×）前列腺癌（20×）平滑肌瘤（20×）抗體經(jīng)多種組織檢測合格操作流程：多肽免疫5只小鼠，免疫血清進(jìn)行ELISA效價(jià)檢測和IHC篩選（2個陽性組織、1個陰性組織）挑選ELISA及IHC均合格的1只小鼠融合主克隆階段，ELISA&IHC（雙組織）>200株結(jié)合陽性，首批73株IHC檢測；挑選12株合格主克隆細(xì)胞進(jìn)行亞克隆篩選。2~3次有限稀釋，ELISA&IHC（多組織）獲得11株ELISA與IHC合格抗體；挑選最優(yōu)的6株克隆放大生產(chǎn)及抗體純化?？贵w質(zhì)控1株抗體IHC多組織驗(yàn)證陽性，可作為診斷原料；3株抗體滿足科研試劑要求。6活性蛋白免疫抗體親和力達(dá)到E-10級別細(xì)胞活性等多功能介入篩選雜交瘤案例——IL15中和抗體開發(fā)13株亞克隆細(xì)胞穩(wěn)定株102株主克隆ELISA競爭抑制陽性(抽檢20株，6株細(xì)胞活性陽性）重組蛋白（細(xì)胞生物活性檢測EC502~8ng/mL）15株亞克隆ELISA競爭陽性40株細(xì)胞2~3輪有限稀釋835孔主克隆ELISA結(jié)合陽性融合后細(xì)胞接種42塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板10只小鼠高效價(jià)，挑選1只進(jìn)行融合Balb/c、C57BL/6小鼠各免疫5只7雜交瘤案例——IL15中和抗體開發(fā)13株抗體均可抑制細(xì)胞，其中11株優(yōu)于對照抗體抗體親和E-10~E-11MKD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)8.78E-114.15E+053.64E-05KD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)2.29E-103.91E+058.94E-05KD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)2.47E-101.97E+054.88E-05Response(nm)Response(nm)MM03HMM11HMM12HResponse(nm)Positivecontrol8雜交瘤技術(shù)的限制因素雜交瘤融合ELISA篩選第一次有限稀釋ELISA篩選第二次有限稀釋ELISA篩選擴(kuò)增生產(chǎn)10-14天陽性克隆7-10天陽性單克隆7-10天陽性單克隆2-3輪有限稀釋篩選及擴(kuò)增生產(chǎn)階段：實(shí)驗(yàn)周期長34~44天（有限稀釋20-30天，生產(chǎn)純化14天）克隆丟失風(fēng)險(xiǎn)——20~30%（有限稀釋轉(zhuǎn)陰率20%）通量限制——人工通量決定工作量大小對于有提基因需求的客戶，需要額外進(jìn)行提基因表達(dá)驗(yàn)證雜交瘤測序問題分析和優(yōu)化10雜交瘤抗體基因測序服務(wù)流程交付周期：5天交付抗體序列多種選擇：多種屬（小鼠、大鼠、兔等）、多亞型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM等）、可變區(qū)或全長抗體測序準(zhǔn)確性高：可排除假基因，成功率100%一站服務(wù)：可提供從抗原生產(chǎn)—抗體制備—雜交瘤細(xì)胞抗體基因測序—抗體表達(dá)驗(yàn)證等一站式服務(wù)11—mAbs,2018,VOL.10,NO.4,539–546沒有目的條帶；可變區(qū)含有終止密碼子；得到多于一條輕鏈或重鏈序列，非特異擴(kuò)增。導(dǎo)致的結(jié)果無表達(dá)；不結(jié)合，或產(chǎn)生非特異性結(jié)合；有效結(jié)合靶點(diǎn)的抗體數(shù)目比預(yù)計(jì)要少，造成抗體表觀結(jié)合較差；多種組合嘗試，工作量加大。雜交瘤抗體提基因異常結(jié)果12雜交瘤抗體提基因問題分析B細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞的等位基因重排；染色體的丟失復(fù)制導(dǎo)致異倍體產(chǎn)生；額外mRNA轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生；—mAbs,2018,VOL.10,NO.4,539–546一個骨髓瘤細(xì)胞與多個脾細(xì)胞融合；污染；融合后重排和突變。13雜交瘤輕鏈雙帶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重新有限稀釋無改善：排除多克隆影響雜交瘤MM02首輪生產(chǎn)雜交瘤MM02再次有限稀釋后生產(chǎn)重新生產(chǎn)無改善：排除生產(chǎn)及純化問題雜交瘤MM01首輪生產(chǎn)文獻(xiàn)參考：約28.6%雜交瘤含多條輕鏈—mAbs,2018,VOL.10,NO.4,539–546雜交瘤MM01二輪生產(chǎn)14雜交瘤提基因?qū)嶒?yàn)優(yōu)化細(xì)胞株方法1方法2方法3序列數(shù)ELISA序列數(shù)序列ELISAMM01不表達(dá)1L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM02不結(jié)合2L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM03不表達(dá)2L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM04不表達(dá)4L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM05不表達(dá)2L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM06不表達(dá)5L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM07不表達(dá)4L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM08不表達(dá)6L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM09不表達(dá)1L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM10不表達(dá)5L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM11提前終止6L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM12提前終止2L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM13提前終止3L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM14提前終止1L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM15提前終止1L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM16提前終止3L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM17不結(jié)合2L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM18不結(jié)合1L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM19(支原體污染)提取失敗3L不結(jié)合1新序列結(jié)合MM20(支原體污染)提取失敗2H不結(jié)合1新序列結(jié)合MM21(支原體污染)提取失敗4L不表達(dá)1新序列結(jié)合MM22提取失敗2L不結(jié)合1新序列結(jié)合MM23(培養(yǎng)不成功)提取失敗1L不表達(dá)1更換信號肽表達(dá)結(jié)合MM24提取失敗1L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM25提取失敗1L不結(jié)合1新序列結(jié)合MM26提取失敗1L結(jié)合1同結(jié)合序列——MM27(生產(chǎn)困難)不結(jié)合——1新序列結(jié)合MM28提取失敗2L不結(jié)合1新序列結(jié)合MM29提取失敗1L結(jié)合1同結(jié)合序列——抗體不表達(dá)；抗體不結(jié)合；序列提前終止；支原體污染；產(chǎn)量低；培養(yǎng)不成功。主克隆提基因優(yōu)勢和案例16雜交瘤融合&主克隆篩選陽性克隆有限稀釋提基因質(zhì)控交付：細(xì)胞株、抗體、序列亞克隆篩選表達(dá)純化生產(chǎn)純化周期節(jié)省20-30天技術(shù)路線比較20-30天14天7天7天新路線傳統(tǒng)路線17兩種上清ELISA檢測對比主克隆上清和重組表達(dá)上清弱陽性和陽性趨勢基本完全一致，提出的基因均是正確序列ELISAOD（蛋白0.1ug/ml包被）ELISA樣品編號18主克隆流式結(jié)果純化抗體流式結(jié)果FACS檢測結(jié)果對比亞克隆流式轉(zhuǎn)陰，主克隆提基因與主克隆流式結(jié)果一致19成藥靶點(diǎn)主克隆提基因細(xì)胞結(jié)合競爭檢測純化抗體細(xì)胞結(jié)合和競爭檢測與主克隆上清檢測結(jié)果一致20周期更短直接交付序列通量更高成功率更高比原有雜交瘤周期節(jié)省20-30天提基因替代有限稀釋，一次提取上百個克隆省去雜交瘤篩選后再提基因步驟，避免基因傳代丟失、污染等風(fēng)險(xiǎn)挽救亞克隆轉(zhuǎn)陰或與主克隆結(jié)果不一致的細(xì)胞克隆雜交瘤主克隆提基因優(yōu)勢更好面向工業(yè)客戶藥篩客戶公司介紹22堅(jiān)持自主研發(fā)生產(chǎn)打造中國生命科學(xué)研究“一站式”試劑與服務(wù)支撐平臺人才與設(shè)施榮譽(yù)資質(zhì)設(shè)施：

---超20,000平米研發(fā)中心---超5,000平米潔凈車間

團(tuán)隊(duì)：近1000人---碩士以上學(xué)歷占1/3---3