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文檔簡介

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)俞萍

pingyu@

88208259

科A713

遺傳病基因突變分析（SSCP）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容7.5

lPCR產(chǎn)物冰水浴中驟冷10分鐘混勻后，100

C沸水中加熱變性10分鐘加樣電泳(140V,~2hr)銀染,約50分鐘7.5

lloadingbuffer（95%甲酰胺）1.5ml離心管遺傳病基因突變分析實(shí)驗(yàn)原理1）DNA抽提2）聚合酶鏈反應(yīng)3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析1）DNA抽提核基因組DNA可以從任何有核細(xì)胞中提出Agarosegelelectrophoresis

雙蒸水10*BufferMgCl2

dNTPs（ATP/CTP/GTP/TTP）

Primer（引物）R+FDNA模板

Taq-DNA聚合酶石蠟油PCR2）聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外由引物介導(dǎo)的特定DNA序列的擴(kuò)增方法.變性：95℃,1min退火：溫度和引物有關(guān)

延伸：

時(shí)間和待擴(kuò)

增產(chǎn)物長度有關(guān)

72℃forTaqStep1(1個(gè)循環(huán))94

C5分鐘Step2(30個(gè)循環(huán))94

C30秒

59

C30秒

72

C30秒

Step3(1個(gè)循環(huán))72

C5分鐘3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性Trp(色氨酸)→Arg(精氨酸)雙甲基丙烯酰胺（methylene-bisacylamide,Bis)單體丙烯酰胺（acrylamide,Acr）TEMED：四甲基乙二胺，加速丙烯酰胺凝膠的聚合

10%APS：（過硫酸胺）催化劑

H2O丙烯酰胺凝膠電泳凝膠組分用于SSCP的藥品和試劑：顯影液Na2CO32.96g

雙蒸水加至100ml,臨用時(shí)配,夏天4℃冷藏甲醛臨用時(shí)加54

l10%硫代硫酸鈉臨用時(shí)加10

l10%乙酸10%乙醇1%HNO3AgNO3載樣緩沖液（loadingbuffer）

95%甲酰胺

20mMEDTA

溴酚藍(lán)少許二甲苯氰少許垂直板電泳槽示意圖

A.電泳槽B.玻璃板C.加樣槽D.制膠架

銀染：

利用銀離子可與核酸結(jié)合的特性，在甲醛作用下銀離子還原為Ag，使凝膠中DNA條帶顯黑色。其操作過程如下：①電泳完的聚丙烯酰胺凝膠用10％的酒精浸泡5分鐘。②棄酒精，加入1%HNO33分鐘，不停搖動。③棄HNO3液，用雙蒸水清洗兩次。④加入AgNO3染液，染色10-20分鐘。⑤用雙蒸水清洗一次。⑥加入顯影液，至清淅的DNA單鏈電泳條帶出現(xiàn)為止。最好是先顯影，棄預(yù)顯影液后，第二次再加入顯影液，顯影至

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