第十單元

生物技術與工程

第33講發(fā)酵工程

［考試內(nèi)容及活動要求］1.進行微生物的分離和培養(yǎng)。2.測定某種微生物的數(shù)量。3.研究培養(yǎng)

基對微生物的選擇作用。4.探討微生物的利用。5.運用發(fā)酵食品加工的基本方法。

考點一微生物的培養(yǎng)、分離與計數(shù)

r知識梳理夯實基礎強化要點

i.培養(yǎng)基

(1)概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質。

(2)營養(yǎng)組成：一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽。此外，還需要滿足微生物生長對出、接

殊營養(yǎng)物質以及氧氣的要求。

(3)種類

①按照物理性質可分為雌培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。

②按照成分的來源可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。

③按照功能用途可分為選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。

2.無菌技術

(1)含義：在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。

(2)常用方法

區(qū)別：能否殺死

3.大腸桿菌的純化培養(yǎng)

(I)制備牛肉膏蛋白腺固體培養(yǎng)基

(2)純化大腸桿菌的方法

①平板劃線法：通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋

分散到培養(yǎng)基的表面。

②稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊

脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。

(3)菌種的保存方法

①對于頻繁使用的菌種，可以采壓臨時保藏的方法。

②對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

4.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

(1)分離原理：土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成蠅，這種物質在把尿素

分解成無機物的過程中起到催化作用。

(2)統(tǒng)計菌落數(shù)目一般用稀釋涂布平板法。

1mL

比菌水

"土樣

領一④

領一0

①統(tǒng)計菌落數(shù)目時，培養(yǎng)基表面生長的1個菌落，來源于樣品稀釋液中的L個活菌。為了保

證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在無邈_的平板進行計數(shù)。

②從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)的計算方法是(平均菌落數(shù)?涂布的稀釋液體

積)x稀釋倍數(shù)。

③利用稀釋涂布平板法成功統(tǒng)計菌落數(shù)目的關鍵是恰當?shù)膿斐潭取?/p>

(3)實驗流程：土壤取樣一枚星的觸一微生物的培養(yǎng)與觀察一細菌的計數(shù)。

【歸納總結】用顯微鏡直接計數(shù)法計數(shù)：血細胞計數(shù)板法

AH

E

血細能計數(shù)板構造(—)

16x25

A.正面圖；B.縱切面圖血細胞計數(shù)板構造(二)

I.血細胞計數(shù)板；2.蓋玻片;放大后的方網(wǎng)格，中間大方

3.計數(shù)室

(1)結構：常用的是1mmX1mmXO.lmm計數(shù)室的計數(shù)板(如圖)。每個計數(shù)板上有兩個方格

網(wǎng)，每個方格網(wǎng)上刻有9個大方格，其中只有中間的大方格為計數(shù)室，大方格的長和寬各為

1mm,深度為0.1mm,其容積為0.1mn?；大方格內(nèi)分為25個中方珞，每一中方格又分為

16個小方格，即大方格是由400個小方格組成的。

(2)操作：在清潔干燥的血細胞計教板的計數(shù)室上加蓋專用的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的菌

液，滴于蓋玻片邊壕，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，充滿計數(shù)室。

(3)計數(shù)：在顯微鏡下計數(shù)4?5個中方格內(nèi)的菌體數(shù)，求出每個小方咯所含有的細菌的平均

數(shù)，按照以下公式計算：每毫升原液含有的菌數(shù)=每小方格平均細菌數(shù)X400X104X原液被

稀釋倍數(shù)。

r?？蓟A診斷」

1.判斷關于微生物培養(yǎng)技術的敘述

(1)培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，有時還需要加入一些特殊的物質(J)

(2)倒平板時，應將打開的皿蓋放到一邊，以免培養(yǎng)基濺到皿蓋上(X)

(3)消毒的原則是既殺死材料表面的微生物，又減少消毒劑對細胞的傷害(V)

(4)為了防止污染，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后應趁熱快速挑取菌落(X)

(5)用稀釋涂布平板法純化大腸桿菌時，只要稀釋度足夠高，就能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落

(J)

2.判斷有關微生物篩選與計數(shù)的敘述

(1)選擇培養(yǎng)基可以鑒定某種微生物的種類(X)

(2)對細菌進行計數(shù)只能采用稀釋涂布平板法，而不能用平板劃線法(X)

(3)篩選能分解尿素的細菌所利用的培養(yǎng)基中，尿素是唯一的氮源(V)

(4)分解尿素的細菌在分解尿素時，可以將尿素轉化為氨，使得培養(yǎng)基的酸堿度降低(X)

「教材熱點拓展」

1.如圖是采用純化微生物培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效果圖，請分析：

(I)獲得圖A效果和圖B效果的接種方法分別是什么？

提示獲得圖A效果的接種方法為稀釋涂布平板法，獲得圖B效果的接種方法為平板劃線

法。

(2)某同學在純化土壤中的細菌時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上的菌落連成了一片，最可能的原因是什么？

應當怎樣操作才可避免此種現(xiàn)象？

提示最可能的原因是菌液濃度過高或劃線時在劃下一區(qū)域前未將接沖環(huán)灼燒滅菌；采取的

措施是增大稀釋倍數(shù)或每次劃新區(qū)域前先將接種環(huán)灼燒滅菌。

(3)接種操作為什么一定要在火焰附近進行？

提示火焰附近存在著無菌區(qū)域。

2.土壤中分解尿素的細菌的分離W計數(shù)所需培養(yǎng)基:

KH2PO414g

Na2HPO42.lg

MgSO4-7H2O0.2g

葡萄糖10.0g

尿素1.0g

瓊脂15.0g

(I)從物理性質看此培養(yǎng)基屬于哪類？

提示固體培養(yǎng)基。

(2)在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？

提示碳源：葡萄糖；氮源：尿素。

(3)怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？

提示如表所示

項目培養(yǎng)基類型是否接種目的結果

以尿素為唯一氮源的只生長尿

實驗組是分離分解尿素的細菌

培養(yǎng)基素分解菌

判斷該培養(yǎng)基有無選生長多種

對照組牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基是

擇性微生物

(4)在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學從對應的1()6倍稀釋的培養(yǎng)

基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落，分

析其原因。

提示原因：①土樣不同；②培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質)。

(5)為什么分離不同的微生物采用不同的稀釋度？

提示因為土壤中各類微生物的數(shù)量不同，數(shù)量多的稀釋倍數(shù)大。

(6)用顯微鏡直接計數(shù)法統(tǒng)計菌落數(shù)量時有什么缺點？

提示不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的

細菌在顯微鏡下難以觀察。

■重點剖析點擊重點攻克難點

------------------------------------------------------------------------------------------N-----------------

1.培養(yǎng)基的配制原則

(1)目的要明確：配制時應根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制的培養(yǎng)基種類。

(2)營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質的濃度和比例。

(3)pH要適宜：細菌為6.5?7.5,放線菌為7.5?8.5,真菌為5.0?6.0,培養(yǎng)不同微生物所需

的pH不同。

2.選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基的比較

種類原理用途舉例

依據(jù)某些微生物對某

從眾多微生物中分離出加入青霉素分離得

選擇培養(yǎng)基些物質或環(huán)境條件的

所需的微生物到酵母菌和霉菌

嗜好、抗性而設計

依據(jù)微生物產(chǎn)生的某

種代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基

伊紅美藍培養(yǎng)基可

鑒別培養(yǎng)基中的特定試劑或化學鑒別不同種類的微生物

以鑒別大腸桿菌

藥品反應，產(chǎn)生明顯

的特價變化而設計

3.消毒和滅菌的辨析

項目條件結果常用方法應用范圍

煮沸消毒法日常用品

較為溫和僅殺死物體表面或

巴氏消毒法不耐高溫的液體

消毒的物理或內(nèi)部的部分微生物

化學藥劑消用酒精擦拭雙手，用

化學方法(不包括芽抱和抱子)

毒法氯氣消毒水源

灼燒滅菌法接種工具

殺死物體內(nèi)外所有

強烈的理干熱滅菌法玻璃器皿、金屬工具

滅菌的微生物，包括芽

化因素高壓蒸汽滅

他和胞子培養(yǎng)基及容器的滅菌

菌法

4.選擇培養(yǎng)基的制作思路

(1)在培養(yǎng)基全部營養(yǎng)成分具備的前提下，加入物質：如培養(yǎng)基中加入高濃度食鹽時可抑制多

種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長，從而可將該菌分離出來；在培養(yǎng)基中加入

青霉素時可抑制細菌、放線菌的生長，但不影響酵母菌和霉菌的生長，從而可將這兩種菌分

離出來。

(2)通過改變培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分達到分離微生物的目的：培養(yǎng)基中缺乏氮源時，可分離自生固

氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而無法生存；培養(yǎng)基中缺乏有機碳源時，自養(yǎng)微生

物可利用空氣中的CS制造有機物生存，而異養(yǎng)微生物則無法生存。

(3)利用培養(yǎng)基的特定化學成分分離特定微生物：如當石油是唯一碳源時，可抑制不能利用石

油的微生物生長，使能夠利用石油的微生物生長，從而分離出能消除石油污染的微生物。

（4）通過某些特殊環(huán)境分離微生物：如在高鹽環(huán)境中可分離耐鹽菌，其他菌在鹽濃度較高時易

失水而不能生存；在高溫環(huán)境中可分離得到耐高溫的微生物，其他微生物在高溫環(huán)境中因酶

失活而無法生存。

5.兩種純化細菌方法的辨析

比較項目平板劃線法稀釋涂布平板法

接種環(huán)在固體平板培養(yǎng)基表面①一系列的梯度稀釋

關鍵操作

連續(xù)劃線②涂布平板法操作

稀釋度要足夠高，為確保實驗

注意事項每次劃線前后均需灼燒接種環(huán)成功可以適當增加稀釋度的范

圍

在具有顯著菌落特征的區(qū)域的從適宜稀釋度的平板上的菌落

菌體獲取

菌落中挑取菌體中挑取菌體

可以根據(jù)菌落的特點獲得某種既可以獲得單細胞菌落，又能

優(yōu)點

微生物的單細胞菌落對微生物進行計數(shù)

缺點不能對微生物計數(shù)操作復雜，需要涂布多個平板

■命題探究預測考向總結方法

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命題點一微生物的培養(yǎng)和無菌技術分析

1.（2018?全國II,37）在生產(chǎn)、生活和科研實踐中，經(jīng)常通過消毒和滅菌來避免雜菌的污染。

回答下列問題：

（I）在實驗室中，玻璃和金屬材質的實驗器具（填“可以”或“不可以”）放入干熱滅

菌箱中進行干熱滅菌。

（2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法，與煮沸消毒法相比，這兩種方法的優(yōu)點

是o

（3）密閉空間內(nèi)的空氣可采用紫外線照射消毒，其原因是紫外線能。

在照射前，適量噴灑,可強化消毒效果。

（4）水廠供應的自來水通常是經(jīng)過（填“氯氣”“乙醇”或“高銹酸鉀”）消毒的。

（5）某同學在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設定要求，而鍋內(nèi)并沒有達到相應溫度，最

可能的原因是O

答案（1）可以（2）在達到消毒目的的同時，營養(yǎng)物質損失較少（3）破壞DNA結構消毒液

（4）氯氣（5）未將鍋內(nèi)冷空氣排盡

解析（1）干熱滅菌是指將物品放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160?170℃條件下加熱1?2h。耐高

溫、需要保持干燥的物品，如玻格器皿（吸管、培養(yǎng)皿）和金屬用具等，可采用干熱滅菌的方

法。（2）巴氏消毒法是在70?75℃條件下煮30min或在80℃條件下玄15min,可以殺死牛

奶中的微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)物質損失較少。（3）接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前，

可以用紫外線照射30min,紫外線能破壞微生物的DNA結構，以殺死物體表面或空氣中的

微生物。在照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以強化消毒效果。（4）自來水

通常是用氯氣進行消毒的。（5）在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設定要求，而鍋內(nèi)并沒

有達到相應溫度，最可能的原因是鍋內(nèi)原有的冷空氣沒有排盡。

2.高溫淀粉酶在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中有很大的實用性。研究者從熱泉中篩選出了能高效生產(chǎn)高

溫淀粉酶的嗜熱菌，其篩選過程如下圖所示。請據(jù)圖回答下列問題：

修

活

0性

鑒

定

（1）1號培養(yǎng)基從物理狀態(tài)來看，屬于固體培養(yǎng)基，配制時要加入作為凝固

劑，從用途來看屬于選擇培養(yǎng)基，應以作為唯一碳源。

（2）配制固體培養(yǎng)基的基本步驟是（）

A.計算、稱量、倒平板、溶化、滅菌

B.計算、稱量、溶化、倒平板、滅菌

C.計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板

D.計算、稱量、滅菌、溶化、倒平板

（3）溶化時，燒杯中加入瓊脂后要不停地，防止瓊脂糊底引起燒杯破裂。對培養(yǎng)

基滅菌的方法一般為o

（4）過程①是,過程②所使用的接種方法是法。

（5）部分嗜熱菌在I號培養(yǎng)基上生長時可釋放分解培養(yǎng)基中的淀粉，在菌落周圍形成

透明圈，挑選相應的菌落，接種到H號培養(yǎng)基進一步分離純化后，再對菌種進行

________________培養(yǎng)。

答案（1）瓊脂淀粉（2）C（3）攪拌高壓蒸汽滅菌（4）稀釋涂布平板（5）淀粉酶擴

大

解析（1）固體培養(yǎng)基中通常加入瓊脂作為凝固劑。本實驗的目的是獲得生產(chǎn)高溫淀粉酶的嗜

熱菌，故其選擇培養(yǎng)基中應以淀粉作為唯一碳源。（2）配制固體培養(yǎng)基的基本步驟是計算、稱

量、溶化、滅菌、倒平板。（3）配制培養(yǎng)基加熱溶化時，要注意加入瓊脂后要不斷攪拌，防止

瓊脂拗底。對培養(yǎng)基的滅菌一般采用高壓蒸汽滅菌法。（4）仔細觀察題目可知，過程①是菌液

稀釋，過程②是采用涂布平板法接種。（5）能產(chǎn)生淀粉酶的部分細菌能分解利用淀粉，其菌落

周圍會出現(xiàn)透明圖，取這樣的菌落再分離純化可獲得相應菌種，以后可以對菌種進行擴大培

養(yǎng)用于生產(chǎn)。

命題點二微生物的純化方法及過程分析

3.（2018?全國m,37）回答下列與酵母菌有關的問題：

⑴分離培養(yǎng)酵母菌通常使用（填“牛肉膏蛋白陳”“MS”或“麥芽汁瓊脂”）

培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基應采用滅菌法滅菌。若將酵母菌劃線接種在平板上，培養(yǎng)一段時

間后可觀察到菌落,菌落的含義是o

（2）酵母菌液體培養(yǎng)時，若通入氧氣，可促進（填"菌體快速增殖”“乙醇產(chǎn)

生”或“乳酸產(chǎn)生”）；若進行厭氧培養(yǎng)，可促進（填"菌體快速增殖”“乙醉產(chǎn)

生”或“乳酸產(chǎn)生”）。

（3）制作面包時，為使面包松軟通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松軟的

原因是。

答案（1）麥芽汁瓊脂高壓蒸汽由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體（2）菌體

快速增殖乙醇產(chǎn)生（3）酵母菌分解葡萄糖會產(chǎn)生CO2,CO?使面包松軟

解析（1）牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基是一種應用廣泛的細菌培養(yǎng)基；MS培養(yǎng)基是滿足植物細胞的

營養(yǎng)和生理需要的培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基通常用于酵母菌（真菌）的培養(yǎng)、鑒定及菌種保

存。培養(yǎng)基的滅菌方法為高壓蒸汽滅菌法。菌落是指由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細

胞群體。（2）酵母菌為兼性厭氧型微生物，在有氧條件下進行有氧呼吸為其自身的繁殖提供能

量；在無氧條件下，酵母菌進行無氧呼吸產(chǎn)生乙醇。（3）面包松軟是因為制作過程中加入的酵

母菌可以分解新葡耨產(chǎn)生大量的CO2,CO?遇熱膨脹，使得制作的面包松軟多孔。

4.牛奶是微生物培養(yǎng)的良好培養(yǎng)基，牛奶在飲用前都要經(jīng)過巴氏消毒，以殺死有害微生物,

為檢測消毒前后牛奶中細菌含量變化情況，做如圖1所示操作。用無菌吸管從錐形瓶中吸取

1mL生牛奶稀釋液至盛有9mL無菌水的試管中，混合均勻，如此再重復2次。請回答下列

有關問題：

ImLImLImL().1mL

90mL無曲水+9mL9mL9mL

10mL生牛奶無菌水無菌水無菌水

圖1

（1）巴氏消毒的方法是,使用這種方法對生鮮牛奶進行消毒的

好處是。

⑵取最終的牛奶稀釋液0.1mL滴在培養(yǎng)基上進行涂布，應選擇的涂布工具是圖2中的

X1//

ABCD

圖2

（3）圖1中所示方法為稀釋涂布平板法，理想情況下，培養(yǎng)一段時間后可在培養(yǎng)基表面形成菌

落。若用該方法培養(yǎng)設置了3個培養(yǎng)皿，菌落數(shù)分別為35個、33個、34個，則可以推測生

牛奶中每亳升含細菌數(shù)為個，運用這種方法統(tǒng)計的結果往往較實際值

（填"偏大”或"偏小”）,原因是。

（4）消毒后的牛奶中絕大部分細菌被殺死，若繼續(xù)用該方法檢測消毒后的牛奶中細菌的數(shù)量,

則在操作步驟上應做什么改動？o

（5）從生牛奶取樣培養(yǎng)得到的菌落中混有各種雜菌，從中檢測出大腸桿菌的方法是在培養(yǎng)基中

加入，若菌落具有特征，則可以認定為大腸桿菌。

答案（1）在70?75C煮30min［或在80C煮15min）牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞（2）8

（3）3.4X106偏小個別菌落可能是由兩個或多個細胞形成的（4）減少稀釋次數(shù)（5）伊紅

美藍（金屬光澤的紫）黑色

解析（1）巴氏消毒的方法是在70?75°C煮30min或在80C煮15min,可以殺死牛奶中的

微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞。（2）涂布使用的工具是涂布器，圖2中B正確。

（3）菌落的平均數(shù)是34個，生牛奶中每毫升含細菌數(shù)=菌落平均數(shù)/涂布量x稀釋倍數(shù)=34個

/0.1mLX104=3.4X1（）6個/爪。在統(tǒng)計菌落時，當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察

到的只是單個菌落，所以運用這種方法統(tǒng)計的結果往往比實際值偏小。（4）由于消毒后牛奶中

絕大部分細菌被殺死，所以可減少稀釋次數(shù)。（5）大腸桿菌的代謝產(chǎn)物會使伊紅美藍鑒別培養(yǎng)

基出現(xiàn)金屬光澤的紫黑色。

命題點三選擇培養(yǎng)基成分及配制方法的分析

5.（2018?全國I,37）將馬鈴薯去皮切塊，加水煮沸一定時間，過濾得到馬鈴薯浸出液。在馬

鈴薯浸出液中加入一定量蔗糖和瓊脂，用水定容后滅菌，得到M培養(yǎng)基。回答下列問題：

⑴M培養(yǎng)基若用于真菌的篩選，則培養(yǎng)基中應加入鏈霉素以抑制的生長，加入了鏈

霉素的培養(yǎng)基屬于培養(yǎng)基。

（2）M培養(yǎng)基中的馬鈴薯浸出液為微生物生長提供了多種營養(yǎng)物質，營養(yǎng)物質類型除氮源外還

有（答出兩點即可）。氮源進入細胞后，可參與合成的生物大分子有

________________（答出兩點即可），

（3）若在M培養(yǎng)基中用淀粉取代蔗糖，接種土壤濾液并培養(yǎng)，平板上長出菌落后可通過加入

顯色劑篩選出能產(chǎn)淀粉酶的微生物。加入的顯色劑是,該方法能篩選出產(chǎn)淀粉酶微

生物的原理是o

（4）甲、乙兩位同學用稀釋涂布平板法測定某一土壤樣品中微生物的數(shù)量，在同一稀釋倍數(shù)下

得到以下結果：

甲同學涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是110、140和149,取平均值133；

乙同學涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是27、169和176,取平均值124。

有人認為這兩位同學的結果中，乙同學的結果可信度低，其原因是

答案（1）細菌選擇（2）碳源、元機鹽蛋白質、核酸

（3）碘液淀粉遇碘液顯藍色，產(chǎn)淀粉酶的菌落周圍淀粉被水解，形成透明圈（4）乙同學的結

果中，1個平板的計數(shù)結果與另2個相差懸殊，結果的重復性差

解析（1）鏈霉素是抗生素，可抑制細菌生長，故在M培養(yǎng)基中加入鏈霉素作為選擇培養(yǎng)基，

可篩選出其菌。（2）培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分一般包括碳源、氮源、水和無機鹽等。細胞中含有氮

元素的生物大分子有蛋白質、核酸等，故所加入的氮源可參與以上物質的合成。（3）淀粉遇碘

變藍，向加有淀粉的培養(yǎng)基中加入碘液后培養(yǎng)基呈現(xiàn)藍色，產(chǎn)淀粉酶的菌落周圍的淀粉被水

解，形成透明圖，可根據(jù)透明圖的大小判斷產(chǎn)生淀粉酶的多少。（4）統(tǒng)計菌落數(shù)時一般選擇菌

落數(shù)在30?300個的平板，甲同學統(tǒng)計的3個平板中的菌落數(shù)在正常范圍內(nèi)且差距不大，比

較準確：乙同學統(tǒng)計的3個平板中，1個平板的計數(shù)結果與另2個相差懸殊，結果的重復性差。

6.苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質，自然界中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的

廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中篩選獲得了只能降解利用苯酚

的細菌菌株，篩選的主要步驟如圖所示，①為土壤樣品。請據(jù)圖回答下列問題：

⑴②中培養(yǎng)目的菌株的選擇培養(yǎng)基中應加入作為碳源，②中不同濃度碳源的培養(yǎng)基

（填“影響”或“不影響”）細菌的數(shù)量，如果要測定②中活細菌數(shù)量，常采用

_______________________法。

（2）④為對照，微生物在④中不生長，在⑤中生長，④與⑤培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于

______________________________________________________________________”采用固體平板

培養(yǎng)細菌時進行倒置培養(yǎng)的原因是。

（3）實驗過程中如何防止其他微生物的污染？

答案（1）苯酚影響稀釋涂布平板（2）④的培養(yǎng)基中沒有加入苯酚作為碳源，⑤的培養(yǎng)基

中加入了苯酚作為碳源防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基（3）培養(yǎng)基滅

菌，接種環(huán)境滅菌，接種過程進行無菌操作

解析（1）選擇只能降解利用苯酚的細菌的培養(yǎng)基是以苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)基；笨酚是唯一

的碳源，當苯酚消耗盡時，菌株因塊少碳源而不能繼續(xù)繁殖，所以②中不同濃度的碳源會影

響細菌數(shù)量：一般采用稀釋涂布平板法來測定②中活菌數(shù)目。（2）④與⑤培養(yǎng)基的主要區(qū)別在

于④的培養(yǎng)基中沒有加入苯酚作為碳源，⑤的培養(yǎng)基中加入了苯酚作為碳源；采用固體平板

培養(yǎng)細菌時要倒置培養(yǎng)，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基。（3）從制備培

養(yǎng)基到接種與培養(yǎng)等全部實驗過程要進行無菌操作。無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，

所有防止雜菌污染的方法。獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵：a.實驗操作的空

間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；b.將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等

進行滅菌；c.為避免周圍環(huán)境中微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行；d.實驗操作

時應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

命題點四微生物分離與計數(shù)的實例分析

7.（2018?防城港一模）某同學要分離土壤中能分解尿素的細菌，并統(tǒng)計單位體積內(nèi)的活菌數(shù)目。

按照培養(yǎng)基的配方稱取，并將各種物質溶解后，用蒸儲水定容、滅菌，制成固體培養(yǎng)基備用。

回答問題：

（I）在配制培養(yǎng)基時，需加入作為唯一的氮源，該培養(yǎng)基從功能上看屬于培

養(yǎng)基，配制好的培養(yǎng)基應用法滅菌。

（2）培養(yǎng)分解尿素的細菌時，在接種前需要檢測培養(yǎng)基是否被污染。對于固體培養(yǎng)基應采用的

檢測方法是________________________________________________________________________

（3）若要統(tǒng)計土壤樣品中尿素分解茵的數(shù)目，宜采用法接種,

根據(jù)土壤樣品的稀釋倍數(shù)和接種稀釋液的體積，統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)目就能大約推測出樣品

中的活菌數(shù)。一同學在稀釋倍數(shù)為IO’的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值為24.6,則每

亳升樣品中的活菌數(shù)是（所用稀釋液的體積為0.2mL）。

（4）實驗中使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過—處理后才能丟棄，以防止微生物的擴散。

答案（1）尿素選擇高壓蒸汽滅菌

（2）將未接種的培養(yǎng)基在適宜溫度下放置適宜的時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生

⑶稀釋涂布平板1.23X106

（4）滅菌

解析（1）要分離土壤中能分解尿素的細菌，在配制培養(yǎng)基時，需加入尿素作為唯一的氮源，

該培養(yǎng)基從功能上看屬于選擇培養(yǎng)基，配制好的培養(yǎng)基應用高壓蒸汽滅菌法滅菌。（2）檢測培

養(yǎng)基是否被污染，需要將未接種的培養(yǎng)基在適宜溫度下放置適宜的時同，觀察培養(yǎng)基上是否

有菌落產(chǎn)生，如果有菌落說明被污染，否則沒有被污染。（3）固體培養(yǎng)基上的接種方法有稀釋

涂布平板法和平板劃線法，稀釋涂布平板法適用于微生物的統(tǒng)計計數(shù)，根據(jù)土壤樣品的稀釋

倍數(shù)和接種稀釋液的體積，統(tǒng)計平板上的平均菌落數(shù)就能夠推測樣品中的活菌數(shù)。在稀釋倍

數(shù)為IO’的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值為24.6,則每毫升樣品中的活菌數(shù)是（所用稀

釋液的體積為0.2mL）為1.23X106。（4）為防止微生物污染環(huán)境和操作者，實

瞼結束后，使用過的培養(yǎng)基必須進行滅菌后倒掉。

8.“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)”實驗的流程：土壤取樣一樣品稀釋一取樣涂布一

微生物的培養(yǎng)一觀察并記錄結果一計數(shù)。在做該實驗時，甲同學在對應106倍稀釋的培養(yǎng)基

中篩選得到250個菌落，但是其他同學在相同的稀釋倍數(shù)下篩選得到160個菌落，請分析并

回答有關問題：

（1）實驗流程中“樣品稀釋一取樣涂布”所用的方法稱之為；利

用該方法統(tǒng)計菌落數(shù)目，____________________________________________________________

將直接影響菌落數(shù)目。

⑵要判斷甲同學實驗結果出現(xiàn)差異的原因需要設置對照，設置對照的主要目的是

有人認為甲同學的實驗結果出現(xiàn)差異的原因是培養(yǎng)基被雜菌污染了，應如何設置對照實驗？

若甲同學的實驗結果出現(xiàn)差異的原因是培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質，又該如何設置對照實

驗？______________________________________________________________________________

若兩者的細菌數(shù)目大致相等，則說明甲同學的培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質。

（3）在細菌分解尿素的反應中，細菌產(chǎn)生的酶可將尿素分解成為氨。為進一步鑒定得

到的細菌是否可以分解尿素，可在培養(yǎng)基中加入指示劑，若該指示劑變紅，則可初

步鑒定該細菌可以分解尿素。

答案（1）稀釋涂布平板法樣品的稀釋程度（或樣品稀釋倍數(shù)）（2）排除非實驗因素對實驗結

果的影響將甲同學的培養(yǎng)基在無菌條件下培養(yǎng)，一段時間后觀察培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目在

普通培養(yǎng)基上接種稀釋的樣品，在無菌條件下培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計菌落數(shù)目（3）胭酚紅

解析（1）實臉流程中“樣品稀釋一取樣涂布”所用的方法稱之為稀釋涂布平板法；稀釋涂布

平板汰足將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的

表面進行培養(yǎng)，在稀釋度足夠高的菌液里，將聚集在一起的微生物分散成單個細胞，獲得由

單個細胞繁殖而來的菌落。因此利用該方法統(tǒng)計菌落數(shù)目，樣品的稀釋程度（樣品稀釋倍數(shù)）

將直接影響菌落數(shù)目。（2）設置對照實臉的主要目的是排除非實驗因素對實驗結果的影響，檢

測培養(yǎng)基是否被污染，需要將未接種的培養(yǎng)基在適宜溫度下放置適宜的時間，觀察培養(yǎng)基上

是否有菌落產(chǎn)生，如果有菌落，說明被污染，否則沒有被污染。檢測選擇培養(yǎng)基是否具有選

擇性，在普通培養(yǎng)基上接種稀釋的樣品，在無菌條件下培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計菌落數(shù)目。若兩者的

細菌數(shù)目大致相等，則說明選擇培養(yǎng)基不具有選擇性。（3）在細菌分解尿素的反應中，尿素分

解菌可以產(chǎn)生豚酶將尿素分解分解為氯，使培養(yǎng)基的pH升高，培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑后，

氮可以使指示劑變紅色，據(jù)此可以用酚紅指示劑鑒別尿素分解菌。

考點二微生物的利用

r知識梳理夯實基礎強化要點

i.果酒和果醋的制作

(1)制作原理與發(fā)醉條件

項目果酒制作果醋制作

菌種酵母菌醋酸菌

菌種

附著在葡萄皮上的野生型酵母菌變酸酒表面的菌膜

來源

有氧條件下，酵母菌通過有氧呼吸大量

氧氣、糖源充足時:C6H12O6+2O2

繁殖：C6Hl2O6+6O2板》6CCh+

麗

發(fā)酵—―2cH3coOH+2CO2+2H2O；

6H2O；

過程缺少糖源、氧氣充足時：C2H50H

無氧條件下，酵母菌通過無氧咽產(chǎn)生

醉

+O2——CH3CQOH+H2O

酒精：2H50H+2c02

-?般酒精發(fā)酵量必C,繁殖最適為

溫度最適為30?35℃

2QC左右

條件前期：雷氨，后期：無氧需要充足的氧氣

時間10?12天7?8天

(2)制作流程

挑選葡萄一沖洗一榨汁一酒精發(fā)酵一醋酸發(fā)酵

II

果酒果醋

2.泡菜的制作

(1)菌種來源：附著在蔬菜上的乳酸菌。

(2)制作原理：在無氧條件下，乳酸菌將葡萄糖分解成乳酸。反應式：C6Hl206f2c3H?3。

(3)制作流程

(4)泡菜制作的注意事項

①材料的選擇及用量

a.蔬菜應新鮮，若放置時間過長，蔬菜中的硝酸鹽易被還原成亞硝酸鹽。

b.清水和鹽的質量比為生11,鹽水要煮沸后冷卻。煮沸有兩大作用，一是除去水中的氧氣，

二是殺滅鹽水中的其他細菌。

②防止雜菌污染：每次取樣用具要洗凈，要迅速封口。

③氧氣需求

a.泡菜壇要選擇透氣性差的容器，以創(chuàng)造無氧環(huán)境，有利于乳酸菌發(fā)酵，防止蔬菜腐爛。

b.泡菜壇壇蓋邊沿的水槽內(nèi)注滿水，以保證壇內(nèi)乳酸菌發(fā)酵所需的無氧環(huán)境，并注意在發(fā)酵

過程中經(jīng)常補水。

④控制適宜的溫度：控制在室溫即可，溫度偏高有害菌活動能力強，溫度偏低不利于乳酸發(fā)

酵。

【歸納總結】傳統(tǒng)發(fā)酵技術中三種常用菌種的比較

項目酵母菌醋酸菌乳酸菌

生物學分類其核生物原核生物原核生物

代謝類型異養(yǎng)兼性厭氧型異養(yǎng)需氧型異兼厭氧型

發(fā)酵條件前期需氧，后期不需氧一直需氧無氧

生長適宜溫度18?25℃30?35℃室溫

生產(chǎn)應用釀酒、發(fā)面釀醋制作酸奶、泡菜

I■?？蓟A診斷」

1.判斷有關果醋和果酒制作的敘述

(1)醋酸菌在無氧條件下利用乙醇產(chǎn)生醋酸(X)

(2)酵母菌是嗜溫菌，所以果酒發(fā)醉所需的最適溫度高于果醋發(fā)酵溫度［X)

(3)在果酒發(fā)酵后期擰開瓶蓋的間隔時間可延長(V)

(4)在家庭中用新鮮前萄制作果酒時，需給發(fā)酵裝置適時排氣(V)

(5)在制作果酒、果醋時，適當加大接種量可以提高發(fā)酵速率、抑制雜菌生長繁殖(V)

(6)利用葡萄發(fā)酵產(chǎn)生果酒的后期，加入醋酸菌即可產(chǎn)生醋酸(X)

2.判斷關于泡菜制作的敘述

(1)泡菜制作的菌種主要是醋酸菌(X)

(2)制作泡菜時，鹽水煮沸后可以立即使用(X)

(3)泡菜壇的選擇、發(fā)酵過程中壇沿要注滿水都有利于泡菜的無氧發(fā)酵iV)

(4)泡菜的制作前期需要通入氧氣，后期應嚴格保持無氧條件(X)

(5)與人工接種的發(fā)酵相比，自然發(fā)酵獲得的產(chǎn)品品質更好(X)

「教材熱點拓展」

1.如圖為果酒和果醋制作的實驗裝置圖，據(jù)圖分析：

甲

⑴甲、乙、丙的作用分別是什么？

提示通入空氣(氧氣)、排氣、取樣(對發(fā)酵的情況進行及時的監(jiān)測)。

(2)圖中發(fā)酵瓶中葡萄汁的量是否恰當？為什么？

提示不恰當，因為葡萄汁的量不能超過發(fā)酵瓶體積的2/3,而且不能將排氣口淹沒。

(3)醋酸菌進行醋酸發(fā)酵時，無論是利用糖源還是酒精，甲都需要打開，請說明原因。

提示醋酸菌是好氧細菌，在發(fā)酵過程中始終需要氧氣，如果氧氣中斷則會引起醋酸菌的死

亡。

(4)果酒擱置時間過久為什么會有酸味？

提示醋酸菌在缺乏糖源時，可以將酒精轉化為乙醛，再將乙醛轉化為醋酸。

2.下圖是泡菜在腌制過程中，乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽的變化規(guī)律，據(jù)圖分析：

(1)從生物間的相互關系和條件變化分析，乳酸菌呈現(xiàn)這種變化規(guī)律的原因是什么？

提示發(fā)酵初期以不產(chǎn)酸的大腸桿菌和醉母菌的活動為主，同時還有一部分硝酸鹽還原菌在

該時期利用氧氣，產(chǎn)生了無氧環(huán)境，乳酸菌開始活動；發(fā)酵中期由于乳酸菌產(chǎn)生了大量乳酸，

其他細菌活動受到抑制，乳酸菌活動增強；發(fā)酵后期由于乳酸的積累，酸度繼續(xù)增長，乳酸

菌活動也受到抑制，乳酸菌數(shù)量下降。

(2)乳酸含量開始很低，中后期急劇增加的原因是什么？

提示發(fā)酵初期有氧氣，乳酸菌活動較弱，中后期氧氣含量減少，乳酸菌大量繁殖，乳酸的

量迅速積累。

(3)分析亞硝酸鹽的含量變化的原因。

提示發(fā)酵初期，乳酸菌和乳酸的量都比較少，而由于硝酸鹽還原菌的活動，亞硝酸鹽含量

逐漸增加；后期由于硝酸鹽還原菌受抑制，同時形成的亞硝酸鹽又被分解，因而亞硝酸鹽含

量下降。

■命題探究預測考向總結方法

------------------------------------------------------------------------------------------N-----------------

命題點一果酒、果醋制作原理的理解

1.(2019?西安調(diào)研)如圖表示果酒和果醋制作過程中的物質變化，下列敘述正確的是()

IHQ產(chǎn)O2II一酸）乩0

③I，④I

1.萄糖kA內(nèi)配!酸+甌?

A.過程①和②都只能發(fā)生在缺氧條件下

B,過程①和③都發(fā)生在酵母菌細胞的線粒體中

C.過程③和④都需要氧氣的參與

D.過程①?④所需的最適溫度基本相同

答案C

解析有氧呼吸和無氧呼吸的第一階段相同，均發(fā)生在細胞質基質中，產(chǎn)物是丙酮酸，而丙

酮酸產(chǎn)生乙醇只能發(fā)生在無氧呼吸過程中，A、B項錯誤：③過程屬于有氧呼吸第二、三階

段，第三階段需要氧氣參與，④過程是制作果醋的過程，需醋酸菌參與，醋酸菌是一種好氧

細菌，因此④過程也需要氧氣參與，C項正確；制作果酒時，最適溫度為18?25℃,而制

作果醋時，最適溫度為30?35C,D項錯誤。

2.果酒是以新鮮水果或果汁為原料，經(jīng)全部或部分發(fā)酵配制而成的，酒精度為7%?18%。

在果酒的基礎上繼續(xù)發(fā)酵可得到果醋。下列有關果酒和果醋制作的敘述中，正確的是（）

A.果酒和果醋的制作都是由酵母菌完成的

B.在果泗制作過程中要定期擰松瓶蓋排放CO2

C.傳統(tǒng)的匐萄酒制作一定需要人工接種菌種

D.葡萄汁裝入發(fā)酵瓶時，要將瓶裝滿

答案B

解析果酒的制作離不開酵母菌，果醋的制作由醋酸菌完成，A錯誤：在果酒制作過程中，

定期排放CO2,避免容器內(nèi)壓力過大，B正確；傳統(tǒng)的葡荀酒制作中起主要作用的是附著在

葡萄皮上的野生型酵母菌，C錯誤；葡萄汁裝入發(fā)酵瓶時，要留有大約1/3的空間，D錯誤。

命題點二果酒、果醋制作的過程和裝置分析

3.（2018?海南，30）葡萄酒是葡萄汁經(jīng)酵母菌發(fā)酵而成的。釀制葡萄酒的兩個簡易裝置如圖所

/J'>0

回答下列問題：

（1）試管中的X溶液有助于維持甲裝置的瓶中氣壓相對穩(wěn)定，與乙裝置相比，用甲裝置釀制葡

萄酒的優(yōu)點是_______________________________________________________________________

.（答出兩點即可）。

（2）葡萄汁裝入甲裝置時，要留有約1/3的空間，這種做法的目的是

___________________________________________________________________________（答出兩點即可）。

（3）某同學若用乙裝置進行發(fā)酵，并設置兩個不同處理組（乙A和乙B）,乙A裝置中保留一定

量的氧氣，乙B裝置中沒有氧氣。在其他條件相同且適宜的情況下，測得一段時間內(nèi)乙A和

乙B中酒精含量的變化趨勢及乙A中氧氣含量的變化趨勢，如曲線圖所示。

物

質

的

含

量

°時間

圖中曲線①、②、③依次表示、、含量的變

化趨勢。

（4）從細胞呼吸類型看，酵母菌屬于生物；從同化作用的類型看，酵母菌屬于

（填“自養(yǎng)”或“異養(yǎng)”）生物。

答案（1）不需要開蓋放氣；避免了因開蓋引起的雜菌污染（2）為酵母菌大量繁殖提供適量的

氧氣；防止發(fā)酵旺盛時汁液溢出（3）乙A中的氧氣乙B中的酒精乙A中的酒精（4）兼

性厭氧異養(yǎng)

解析（1）試管中的X溶液有助于維持甲裝置的瓶中氣壓相對穩(wěn)定，與乙裝置相比，用甲裝置

釀制葡萄酒的優(yōu)點是不需要開蓋放氣；避免了因開蓋引起的雜菌污染。（2）葡萄汁裝入甲裝置

時，要留有約1/3的空間，這種做法的目的是為酵母菌大量繁殖提供適量的氧氣；防止發(fā)酵

旺盛時汁液溢出。（3）分析題意可知，圖中曲線①、②、③依次表示乙A中的氧氣、乙B中的

酒精、乙A中的酒精含量的變化趨勢。（4）從細胞呼吸類型看，酵母菌屬于兼性厭氧生物；從

同化作用的類型看，酵母菌屬干異養(yǎng)生物C

4.葡萄發(fā)酵可產(chǎn)生葡萄酒，請利用相關知識回答下列問題：

（1）利用葡萄制作葡萄酒的過程，發(fā)揮作用的微生物是o

⑵該微生物通過無氧呼吸可分解,產(chǎn)生的終產(chǎn)物是和

（3）甲、乙、丙三位同學將葡萄榨成汁后分別裝入相應的發(fā)酵瓶中，在溫度等適宜的條件下進

行發(fā)酵，如圖所示。發(fā)酵過程中，每隔一段時間均需排氣一次。據(jù)圖分析，甲同學和丙同學

的操作有誤，其中甲同學的錯誤是，導致發(fā)酵中出

現(xiàn)的主要異常現(xiàn)象是;丙同學的錯誤是，

導致發(fā)酵中出現(xiàn)的主要異常現(xiàn)象是-

上述發(fā)酵過程結束后，甲、乙、丙同學實際得到的發(fā)酵產(chǎn)品依次是、

夾子

甲乙丙

注：各發(fā)酵瓶的左側管為充

氣管.右側管為排氣管

(4)在上述制作葡萄酒的過程中，假設乙同學的某一步驟操作錯誤導致發(fā)酵瓶瓶塞被沖開，該

操作的錯誤是o

答案(1)酵母菌(2)葡萄糖酒精CO2(3)未夾住發(fā)酵瓶的充氣管發(fā)酵液從充氣管流

出，發(fā)酵液變酸瓶中發(fā)酵液過多，淹沒了排氣管在瓶內(nèi)的管口排氣時發(fā)酵液從排氣管流

出葡萄醋葡萄酒葡萄酒(4)未及時排氣

解析在制作各種酒的過程中，常用酵母菌作菌種：酒精發(fā)酵是在無氧條件下進行的，甲同

學未夾住發(fā)酵瓶的充氣管，從而使氧氣進入瓶內(nèi)，導致酵母菌進行有氧呼吸，產(chǎn)生較多的二

氧化碳，使發(fā)酵液從充氣管流出，發(fā)酵液變酸；丙同學的錯誤是瓶中發(fā)酵液過多，淹沒了排

氣管，抑制了發(fā)酵的進行，一般發(fā)酵液不得超過容器體積