第十章

高效液相色譜法葉樺珍福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院教學(xué)目標(biāo)

掌握化學(xué)鍵合相色譜法；高效液相色譜法對固定相和流動(dòng)相的要求與選擇方法。熟悉實(shí)驗(yàn)條件的選擇；高效液相色譜儀的組成。了解高效液相色譜法的特點(diǎn)和分類；高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用。第三節(jié)

實(shí)驗(yàn)條件的選擇一、色譜柱相關(guān)條件的選擇（一）色譜柱填料類型選擇

高效液相色譜的色譜填料種類較多，如硅膠、高分子多孔微球、化學(xué)鍵合相、包覆聚合物柱填料、微粒多孔碳填料等?；瘜W(xué)鍵合固定相最常用。化學(xué)鍵合相

化學(xué)鍵合相是利用化學(xué)反應(yīng)通過共價(jià)鍵將有機(jī)分子鍵合到載體表面，形成牢固、均一的單分子薄層。不易流失，穩(wěn)定性高，色譜柱使用壽命長；均一的單分子薄層，傳質(zhì)阻力小，傳質(zhì)快，柱效高；分離選擇性高，適用于不同性質(zhì)物質(zhì)的分離；可用于梯度洗脫，重現(xiàn)性高；載樣量大。

1.化學(xué)鍵合相的特點(diǎn)2.化學(xué)鍵合相的分類化學(xué)鍵類型Si-O-Si-C型Si-O-CSi-N型固定液的極性極性鍵合相鍵合基團(tuán)為-CN、-NH2

正相色譜中等極性鍵合鍵合基團(tuán)為醚基和二羥基非極性鍵合相鍵合基團(tuán)為C18、C8

反相色譜離子交換鍵合相

（二）色譜柱規(guī)格的選擇

常用的分析型色譜柱柱長10cm～25cm，內(nèi)徑2.1mm～4.6mm，填料粒徑3～10μm,用于常規(guī)的分離分析。半制備柱與制備柱內(nèi)徑一般在6mm以上，用于制備目的?？焖俜治鲋膬?nèi)徑一般為6mm或更大，柱長30?80mm，填料粒徑為3um或者更小,適應(yīng)于快速分析需求。微徑柱內(nèi)徑1mm或更小內(nèi)徑的毛細(xì)管柱，適應(yīng)于電色譜等特殊需要。（三）色譜柱柱溫的選擇

色譜柱柱溫會(huì)影響分離效果和分析時(shí)間，柱溫的波動(dòng)會(huì)影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)維持柱溫的恒定。如無特殊說明色譜柱溫度系指室溫，色譜柱的最高使用柱溫為60度調(diào)高柱溫會(huì)加快傳質(zhì)，縮短分析時(shí)間。二、流動(dòng)相相關(guān)條件的選擇（一）高效液相色譜法流動(dòng)相的要求1.純度要高配制流動(dòng)相的水要求為高純水或二次蒸餾水，溶劑為色譜純試劑。2.黏度要低?采用甲醇、乙腈等低粘度的溶劑可降低色譜柱柱壓，提高柱效。3.化學(xué)惰性不能與固定相或被測組分發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)，不改變填料的任何性質(zhì)。4.溶解度適宜對試樣有適宜的溶解度，試樣在流動(dòng)相中不能析出。（二）流動(dòng)相種類的選擇

常常采用烴類等非極性或弱極性有機(jī)溶劑為主體，加入醇、氯仿、乙腈等極性較大的溶劑調(diào)節(jié)其極性

常常采用水或無機(jī)鹽緩沖液、弱酸、弱堿作為主體，加入甲醇、乙腈、四氫呋喃等有機(jī)溶劑調(diào)節(jié)其極性1.正相鍵合相色譜法2.反相鍵合相色譜法3.流動(dòng)相洗脫方式的選擇

等度洗脫：在洗脫過程中流動(dòng)相的組成恒定

梯度洗脫：洗脫過程中流動(dòng)相的組成和配比不斷改變，需配有梯度洗脫裝置。

應(yīng)用梯度洗脫時(shí)，應(yīng)注意以下問題：（1)所用溶劑的純度要很高（2)溶劑間要有互溶性（3)混合溶劑的粘度會(huì)隨組成而變化，在梯度洗脫時(shí)會(huì)出現(xiàn)壓力的變化

（4)應(yīng)用緩沖溶液與有機(jī)溶劑混合時(shí)可能會(huì)析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用

磷酸鹽時(shí)需特別小心。（5)進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辯認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰。（三）流動(dòng)相應(yīng)用要求1.須新鮮制備2.使用前應(yīng)過濾3.使用前應(yīng)脫氣4.貯液瓶中流動(dòng)相應(yīng)足量5.維持流動(dòng)相的pH在一定的范圍內(nèi)6.防止含緩沖鹽的流動(dòng)相中緩沖鹽的析出7.應(yīng)用不同流動(dòng)相時(shí)注意“過渡”為保護(hù)色譜柱，實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相應(yīng)避免組成及極性劇烈變化。三、檢測器的選擇

檢測器的種類

適合檢測的對象紫外檢測器（UVD