第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用（一）微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)（1）賀老師第1章發(fā)酵工程食用自制酸奶導(dǎo)致腸胃不適屢見(jiàn)不鮮葡萄酒、酸菜等變質(zhì)從社會(huì)中來(lái)2、怎么才能保證無(wú)處不在的雜菌不混入發(fā)酵物中呢？1、失敗的原因是什么？主要原因是在制作過(guò)程中有雜菌大量繁殖①制作工具和原料進(jìn)行消毒滅菌②接種純的單一菌種③控制發(fā)酵條件（如制作泡菜時(shí)創(chuàng)造無(wú)氧環(huán)境），避免雜菌繁殖非細(xì)胞類(lèi)原核類(lèi)真核類(lèi)病毒：新冠病毒等RNA病毒；

噬菌體等DNA病毒微生物細(xì)菌：乳酸菌、大腸桿菌等；藍(lán)細(xì)菌、放線菌、支原體等（口訣：藍(lán)色細(xì)線織毛衣）單細(xì)胞真菌：酵母菌、霉菌等；原生生物：草履蟲(chóng)、衣藻等微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱(chēng)，包括細(xì)菌、真菌和病毒等。p9本章提及的微生物主要指用于發(fā)酵所用的細(xì)菌和真菌。

微生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小，眼睛看不到，若想得到純凈的微生物，就必須對(duì)其進(jìn)行

。分離和培養(yǎng)菌落1.定義：

2.特征：3.功能：知識(shí)補(bǔ)充：菌落單個(gè)或少數(shù)同種菌體在固體培養(yǎng)基上大量繁殖，形成肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體。形狀、大小、顏色、光澤度、透明度等。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。青霉菌一個(gè)菌落是一個(gè)種群還是一個(gè)群落？√(1）提供微生物生長(zhǎng)繁殖所需營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件(2）確保其它微生物無(wú)法混入(3)并將需要的微生物分離出來(lái)培養(yǎng)基無(wú)菌技術(shù)1.研究和應(yīng)用微生物的前提（發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)）是：

、

。防止雜菌污染獲得純凈的微生物培養(yǎng)物2.實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物基本要求：酵母菌純化培養(yǎng)培養(yǎng)基的配置人們按照微生物對(duì)

的不同需求，配制出供其

的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖①培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物。②積累其代謝物。1.概念：2.作用：3.類(lèi)型：（1）按物理性質(zhì)分：液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基不含瓊脂半固體培養(yǎng)基無(wú)動(dòng)力含0.2%-0.5%瓊脂含1.5%-2.5%瓊脂擴(kuò)大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類(lèi)鑒定（有無(wú)鞭毛）微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種瓊脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固有動(dòng)力(彌散)3.類(lèi)型：（2）按化學(xué)成分分：培養(yǎng)基的配置作用：用于實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的營(yíng)養(yǎng)、代謝、遺傳、鑒定和生物測(cè)定等定量要求較高的研究培養(yǎng)細(xì)菌常用的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3g，蛋白胨5g，水1000mL。培養(yǎng)真菌的察氏培養(yǎng)基硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)

0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30g，瓊脂15~20g，蒸餾水1000mL，pH自然或7.0~7.2。作用：配制實(shí)驗(yàn)室常用培養(yǎng)基和工業(yè)生產(chǎn)合成培養(yǎng)基：用已知的化學(xué)物質(zhì)配制天然培養(yǎng)基：含有化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不明確的天然有機(jī)物。天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基3.類(lèi)型：（3）按用途分：培養(yǎng)基的配置選擇培養(yǎng)基：鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)。將某種類(lèi)微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)。加入能與目的菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑。用于鑒別不同類(lèi)型的微生物?；A(chǔ)培養(yǎng)基：含一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耐高濃度食鹽的金黃色葡萄球菌伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基能與大腸桿菌代謝物反應(yīng)，出現(xiàn)帶金屬光澤的深紫色菌落劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類(lèi)特點(diǎn)用途物理性質(zhì)化學(xué)成分用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂、明膠擴(kuò)大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類(lèi)鑒定微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)人工合成、成分明確菌種分類(lèi)、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng),促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)微生物培養(yǎng)、分離在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品，用以鑒別不同種類(lèi)的微生物鑒別選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基人們按照微生物對(duì)

的不同需求，配制出供其

的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖培養(yǎng)基：（2）異化作用（分解代謝）：是指生物體能夠把自身的一部分物質(zhì)加以分解，

出其中的能量，并且把分解的終產(chǎn)物排出體外的變化過(guò)程。知識(shí)補(bǔ)充：代謝類(lèi)型1.新陳代謝概念機(jī)體與內(nèi)環(huán)境之間的物質(zhì)和能量交換以及生物體內(nèi)物質(zhì)和能量的自我更新過(guò)程。是生物體內(nèi)全部有序的化學(xué)變化的總稱(chēng)。（1）同化作用(合成代謝)：是指生物體把從外界環(huán)境中獲取的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成自身的組成物質(zhì)，并且

能量的變化過(guò)程。根據(jù)生物體在同化作用過(guò)程中能不能利用無(wú)機(jī)物制造有機(jī)物自養(yǎng)型：異養(yǎng)型：綠色植物、光合細(xì)菌、硝化細(xì)菌、鐵細(xì)菌、硫細(xì)菌等動(dòng)物、大多數(shù)細(xì)菌和真菌等根據(jù)生物體在異化作用過(guò)程中對(duì)氧的需求情況需氧型：厭氧型：兼性厭氧型：絕大多數(shù)動(dòng)植物、好氧型細(xì)菌、大多數(shù)真菌等乳酸菌、破傷風(fēng)桿菌、及動(dòng)物體內(nèi)寄生蟲(chóng)（蛔蟲(chóng)）等酵母菌儲(chǔ)存釋放4.培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成：無(wú)機(jī)碳源：（1）碳源（提供碳元素）（2）氮源（提供氮元素）氮是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的元素。有機(jī)碳源：糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、石油等CO2、CO32-、HCO3-等異養(yǎng)微生物有機(jī)氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素CO(NH2)2、氨基酸等

無(wú)機(jī)氮源：NH4＋、NO3-、N2、NH3等功能：①調(diào)節(jié)PH

功能：①良好的溶劑①構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物

②有機(jī)碳既是碳源又是能源物質(zhì)（1）基本成分：碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽自養(yǎng)微生物（4）水（3）無(wú)機(jī)鹽功能：②維持滲透壓②維持生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定（結(jié)合水）功能：（2）特殊需求：培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的需求。④培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，需要提供

的條件。①培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，需要在培養(yǎng)基中添加

；②培養(yǎng)霉菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；③培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；維生素酸性中性或弱堿性無(wú)氧主要指生長(zhǎng)因子：維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等思考：所有微生物是否都可以用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)?否。病毒是沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微生物,必須在活細(xì)胞內(nèi)寄生并以復(fù)制的方式增殖,因此不能用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。生長(zhǎng)因子：通常是指微生物自身不能合成或合成量不足，但又是微生物生長(zhǎng)和代謝所必需的小分子。4.培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成：3.含有C、H、O、N的有機(jī)物可作為

微生物的碳源、氮源、能源；微生物碳源氮源能源藍(lán)細(xì)菌硝化細(xì)菌根瘤菌大腸桿菌CO2NH4＋、NO3-等光能CO2NH3NH3氧化的化學(xué)能糖類(lèi)等有機(jī)物N2有機(jī)物中的化學(xué)能糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等有機(jī)物蛋白質(zhì)、NH4＋、NO3-等有機(jī)物中的化學(xué)能1.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物培養(yǎng)基的主要差別在于

；2.無(wú)機(jī)氮源不但能給有些自養(yǎng)型微生物提供

，也能作為

，碳源氮源能源物質(zhì)異養(yǎng)型NH3：既是硝化細(xì)菌的氮源，又是它的能源物質(zhì)光能自養(yǎng)化能自養(yǎng)異養(yǎng)、固氮菌異養(yǎng)4.同一種物質(zhì)不能既做碳源又做氮源（

）牛肉膏或蛋白胨，可為異養(yǎng)微生物提供碳源和氮源×思考討論（1）防止培養(yǎng)物被雜菌污染（2）防止感染實(shí)驗(yàn)操作者1目的2類(lèi)型超凈工作臺(tái)無(wú)菌技術(shù)是指使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。是指使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。消毒：滅菌：微生物接種操作時(shí)為什么要“全副武裝”和在專(zhuān)門(mén)的設(shè)備內(nèi)進(jìn)行？芽孢：芽孢和孢子孢子：細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的無(wú)性生殖細(xì)胞(是繁殖體)。能直接發(fā)育成新個(gè)體。知識(shí)拓展有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體(不是繁殖體)，叫作芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜(如溫度、水分適宜)的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌。3對(duì)象無(wú)菌技術(shù)【注意事項(xiàng)】p10最后一段①實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周?chē)奈锲?/p>

。②為避免周?chē)h(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在：

。超凈工作臺(tái)上并在酒精燈火焰附近進(jìn)行相接觸①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行

。清潔和消毒②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行

。滅菌培養(yǎng)皿滅菌桶煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥物消毒法紫外線消毒100℃煮5~6min。可殺死微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。62~65℃煮30min或80~90℃下處理0.5~1min?？蓺⑺澜^大部分微生物，不破壞食物的營(yíng)養(yǎng)成分。用75%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)用紫外線照射30min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。4常用的消毒方法無(wú)菌技術(shù)1.對(duì)食物、快遞的外包裝和電梯的墻壁等外表面、空氣進(jìn)行消毒分別用什么方法？利用高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致微生物死亡。利用化學(xué)藥物殺死各種微生物紫外線破壞微生物的DNA結(jié)構(gòu)5常用的滅菌方法無(wú)菌技術(shù)①濕熱滅菌：利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。高壓蒸汽滅菌：（效果最好）實(shí)驗(yàn)室常用高壓蒸汽滅菌鍋，在壓力100kPa、溫度121℃條件下，維持15-30min原理：對(duì)象：優(yōu)點(diǎn)：高溫蒸汽破壞蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)使其變性操作簡(jiǎn)便，效果可靠，可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體?；颈３峙囵B(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不破壞。培養(yǎng)基、部分塑料制品高壓蒸汽滅菌鍋②干熱滅菌：干熱滅菌箱內(nèi)，在160-170℃的熱空氣中維持下2-3h達(dá)到滅菌目的原理：使微生物細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性和原生質(zhì)干燥等對(duì)象：耐高溫，需保持干燥的物品玻璃器皿（如試管、培養(yǎng)皿、吸管、注射器等）金屬器具（如針頭、鑷子、剪刀等）5常用的滅菌方法無(wú)菌技術(shù)干熱滅菌箱③灼燒滅菌：5常用的滅菌方法無(wú)菌技術(shù)

酒精燈火焰灼燒最徹底充分燃燒層

（外焰）使微生物燃燒a.接種工具如接種環(huán)、涂布器b.接種過(guò)程中的試管口或瓶口等易被污染部位效果：原理：對(duì)象：涂布器不耐高溫的液體（牛奶）：接種室、超凈工作臺(tái)：培養(yǎng)皿、吸管等玻璃器皿：接種環(huán)等金屬工具：實(shí)驗(yàn)操作者的雙手：培養(yǎng)基：家庭餐具等生活用品消毒：鞏固練習(xí)：將以下器具、物品或?qū)ο笈c所采用的消毒或滅菌方法連線煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑消毒紫外線消毒灼燒滅菌干熱滅菌高壓蒸汽滅菌酒精消毒液中酒精濃度對(duì)效果的影響：75%的酒精殺菌效果最好；濃度過(guò)高，菌體表面蛋白質(zhì)變性過(guò)快而凝固成一層保護(hù)膜，酒精不能滲入其中；濃度過(guò)低，殺菌能力減弱。1.下表是某微生物培養(yǎng)基的成分，請(qǐng)分析該培養(yǎng)基可用來(lái)培養(yǎng)哪種微生物？若除去①，此培養(yǎng)基可用來(lái)培養(yǎng)圓褐固氮菌嗎？編號(hào)①②③④⑤成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量/g0.44.00.50.5100mL此培養(yǎng)基不含有機(jī)碳源，可用來(lái)培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物。2．培養(yǎng)微生物時(shí)，培養(yǎng)基中是否必須有碳源和氮源？不一定。培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物時(shí)，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空氣中的CO2；培養(yǎng)固氮微生物時(shí)，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空氣中的N2。圓褐固氮菌雖可以固氮，但其同化作用類(lèi)型為異養(yǎng)型，培養(yǎng)基中必須提供有機(jī)碳源，所以該培養(yǎng)基不能用來(lái)培養(yǎng)圓褐固氮菌。泡菜制作過(guò)程中，乳酸菌、乳酸及亞硝酸鹽的含量變化發(fā)酵時(shí)期乳酸菌乳酸亞硝酸鹽發(fā)酵初期發(fā)酵中期發(fā)酵后期曲線模型少（有氧氣，乳酸菌的活動(dòng)受到抑制）少增加（硝酸鹽還原菌的作用）最多（乳酸抑制

其他菌活動(dòng)）積累增多（PH下降）下降（硝酸鹽還原菌受抑制，

部分亞硝酸鹽被分解）減少（乳酸積累，PH下降，可能抑制其活動(dòng)）繼續(xù)增多（PH繼續(xù)下降）