膠原蛋白凝膠-眼刺激性試驗CollagenHydrogel-EyeIrritationTest范圍本方法規(guī)定了化妝品用化學(xué)原料膠原蛋白凝膠-眼刺激性試驗的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品用化學(xué)原料的眼刺激性/腐蝕性檢測。試驗?zāi)康念A(yù)測和評價化妝品用化學(xué)原料對眼睛是否具有刺激性/腐蝕性。定義眼睛刺激性eyeirritation眼球表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。眼睛腐蝕性eyecorrosion眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷?？缒る娮鑤ransepithelialelectricalresistance，TEER跨細(xì)胞層的電阻，表征細(xì)胞層的完整性，單位Ω·cm2。試驗原理將人角膜上皮細(xì)胞接種在膠原蛋白凝膠上構(gòu)建人角膜上皮模型，通過檢測暴露于受試物后人角膜上皮模型的跨膜電阻隨時間的變化來判斷角膜上皮屏障的破壞程度，進(jìn)而預(yù)測和評價受試物的眼刺激性/腐蝕性檢測。試驗材料與試劑細(xì)胞株采用人角膜上皮細(xì)胞HCE-T，該細(xì)胞為貼壁生長。要求來源清晰，代數(shù)明確（＜25代）。培養(yǎng)基采用DMEM-F12（1：1）混合配養(yǎng)基，加入5%胎牛血清、5μg/mL人重組胰島素、10ng/mL人重組表皮生長因子、0.5%DMSO、100UI/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。受試物的配制受試物溶液或懸浮液由培養(yǎng)基配制，濃度為2.5%（w/v）。優(yōu)先選擇手動混勻。若受試物不能溶解，則依次選擇下述方法促進(jìn)溶解：a.渦旋，時間不超過1min；b.超聲，時間不超過2min；c.加熱，最高溫度不超過70℃。當(dāng)受試物通過以上方法仍不能溶解或形成均勻懸浮液，則應(yīng)渦旋混勻后立即使用。受試物應(yīng)在使用前新鮮配制，否則必須證實儲存不影響其穩(wěn)定性。對照溶液的配制陽性對照溶液：稱取250mg苯扎氯銨，溶解于10mL培養(yǎng)基中，可以超聲加速溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。參考品對照溶液：稱取250mg乙醇，溶解于10mL培養(yǎng)基中，現(xiàn)用現(xiàn)配。陰性對照溶液：稱取250mg生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液），溶解于10mL培養(yǎng)基中，現(xiàn)用現(xiàn)配。試驗步驟角膜上皮模型的制備膠原蛋白凝膠膜的準(zhǔn)備從4℃冰箱取出嵌入性膠原蛋白干凝膠膜小室，放入12孔板中，恢復(fù)至室溫，向小室的外側(cè)和內(nèi)側(cè)分別加入1.5mL和0.5mL培養(yǎng)基，平衡10min，即得到膠原蛋白凝膠膜。角膜上皮模型的構(gòu)建將小室外側(cè)的培養(yǎng)基更換為1.5mL新鮮培養(yǎng)基，吸走小室內(nèi)側(cè)的培養(yǎng)基，向小室內(nèi)加入0.5mL密度為1.2×105個細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液（即6×104個細(xì)胞/小室），培養(yǎng)2d后，更換小室外側(cè)的培養(yǎng)基，吸走小室內(nèi)側(cè)的培養(yǎng)基，氣-液界面培養(yǎng)4d~6d，隔天更換小室外側(cè)培養(yǎng)基。角膜上皮模型跨膜電阻的測定氣-液界面培養(yǎng)第6d時，測定角膜上皮模型的跨膜電阻（TEER）。更換小室外側(cè)的培養(yǎng)基為1.5mL新鮮培養(yǎng)基，向小室內(nèi)側(cè)加入0.5mL新鮮培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基的溫度為28±2℃，將電阻計的長和短電極分別插入小室的外和內(nèi)側(cè)，測定角膜上皮模型的TEER，TEER值介于140Ω·cm2~220Ω·cm2之間時方可使用。TEER的計算見公式1。 TEER（Ω·cm2）=R（Ω）×面積（cm2） 公式1其中，R（Ω）為測量的電阻值，面積為角膜上皮模型的面積。樣品測定分組2.5%（w/v）的受試物用于試驗。應(yīng)設(shè)定空白對照、陰性對照、參考品對照和陽性對照。未種細(xì)胞的膠原蛋白凝膠為空白對照。生理鹽水、乙醇和苯扎氯銨分別為陰性、參考品和陽性對照。每組3個重復(fù)。受試物的暴露和TEER測定更換小室外側(cè)的培養(yǎng)基為1.5mL新鮮培養(yǎng)基，向小室內(nèi)側(cè)加入0.5mL待測液，記錄3min內(nèi)模型TEER值的變化，每10s記錄一次，試驗溫度為28±2℃。計算以暴露時間（s）為橫坐標(biāo)，以扣除空白對照的TEER值在初始值中百分比（%）為縱坐標(biāo)，作圖（圖1）。根據(jù)圖1計算延遲時間（s）、強(qiáng)度（%/s）和坪值（%），計算公式見公式2~公式4。暴露時間（s）暴露時間（s）t1t2t3P3P2P1100TEER（%）圖1受試物暴露角膜上皮模型后TEER值變化示意圖 延遲時間（s）=t1 公式2 強(qiáng)度（%/s）=-（P2-P1）/（t2-t1） 公式3 坪值（%）=100-P2 公式4其中，t1表示跨膜電阻維持-0.03%/s＜dP/dT≤0的最長時間；t2表示dP/dT≤-0.03%/s后，跨膜電阻再次變?yōu)閐P/dT＞-0.03%/s的起始時間；t3表示t2+30s；P1、P2和P3分別表示t1、t2和t3時對應(yīng)的TEER值的百分比；dP/dt表示以t對P求導(dǎo)數(shù)。結(jié)果判定根據(jù)表1判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行刺激性判定。表1判定標(biāo)準(zhǔn)條件結(jié)果延遲時間≤180s，或強(qiáng)度≥0.05%/s，或坪值＞5.0%無法判定延遲時間＞180s，或強(qiáng)度＜0.05%/s且坪值≤5.0%無刺激性系統(tǒng)成立的條件需同時滿足以下4個條件，試驗方能成立：（1）陰性對照延遲時間＞180s，或坪值≤5.0%；（2）陽性對照坪值≥40%；（3）參考品對照坪值≥10%；（4）每個樣品三次重復(fù)測定的電阻值的標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤15%。結(jié)果解釋當(dāng)受試物延遲時間＞180s，或強(qiáng)度＜0.0