第2節(jié)基因工程操作程序1/261.說(shuō)出基因工程操作程序。2.記住獲取目標(biāo)基因方法。3.記住將目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞方法。4.說(shuō)出目標(biāo)基因檢測(cè)和表示產(chǎn)物測(cè)定方法。2/26一二三四一、目標(biāo)基因取得1.目標(biāo)基因是指人們所需要進(jìn)行研究基因。2.目標(biāo)基因獲取方法主要有兩種:化學(xué)合成法和從基因組中直接分離法。3.化學(xué)合成法是指利用化學(xué)反應(yīng)直接合成基因。該方法主要適合用于已知核苷酸序列、相對(duì)分子質(zhì)量較小目標(biāo)基因制備。4.從基因組中直接分離法是當(dāng)前取得目標(biāo)基因主要伎倆。5.因?yàn)檎婧松锘蚪M較大,分離目標(biāo)基因時(shí),往往要依據(jù)已取得信息,采取很多綜合分子生物學(xué)技術(shù),如利用DNA擴(kuò)增儀(PCR儀)直接擴(kuò)增目標(biāo)基因;也能夠利用反轉(zhuǎn)錄法,以mRNA為模板,借助反轉(zhuǎn)錄酶,經(jīng)過(guò)PCR儀合成與mRNA序列互補(bǔ)DNA片段,然后在聚合酶作用下合成雙鏈DNA,從而取得所需要目標(biāo)基因。3/26一二三四二、基因表示載體構(gòu)建1.大腸桿菌質(zhì)粒DNA提取:最慣用方法是堿裂解法。2.基因表示載體構(gòu)建:以質(zhì)粒為例,首先要用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒,使環(huán)狀質(zhì)粒出現(xiàn)一個(gè)切口,露出DNA末端,然后用一樣

限制性內(nèi)切酶去切割目標(biāo)基因,使目標(biāo)基因暴露出一樣DNA末端。在DNA連接酶作用下,將有切口質(zhì)粒與一樣末端目標(biāo)基因連接在一起,形成含有目標(biāo)基因新環(huán)狀質(zhì)粒DNA分子表示載體。3.除了利用質(zhì)粒作運(yùn)載體外,還能夠用病毒作運(yùn)載體。因?yàn)椴《竞茌p易靠近寄主細(xì)胞,人們把病毒DNA分子進(jìn)行改造,將病毒有害基因去掉,換上目標(biāo)基因,這么經(jīng)過(guò)改造病毒DNA分子用蛋白質(zhì)“包裝”之后,很輕易地將目標(biāo)基因送進(jìn)寄主細(xì)胞中。4/26一二三四思索：基因工程關(guān)鍵步驟是什么?在此操作中用到哪些工具酶?提醒:基因表示載體構(gòu)建是基因工程關(guān)鍵步驟。在此操作中要用到限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶兩種工具酶。5/26一二三四三、目標(biāo)基因?qū)?.將目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞方法有:花粉管通道法、氯化鈣法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法、基因槍法以及電擊法、聚乙二醇法等。2.花粉管通道法花粉管通道法是指外源基因利用植物受精后花粉萌發(fā)形成

花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞,借助天然種胚系統(tǒng)形成含有目標(biāo)基因種胚。3.氯化鈣法假如運(yùn)載體是質(zhì)粒,受體細(xì)胞是大腸桿菌,最慣用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是氯化鈣法。這一方法也是擴(kuò)增表示載體慣用方法,受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一定濃度氯化鈣處理后,細(xì)胞膜通透性會(huì)發(fā)生改變,能夠允許含有目標(biāo)基因運(yùn)載體分子進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。6/26一二三四4.農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法(1)農(nóng)桿菌是一個(gè)土壤細(xì)菌,它侵染植物細(xì)胞后,會(huì)使植物組織形成腫瘤。農(nóng)桿菌中存在一個(gè)環(huán)形Ti或Ri質(zhì)粒,質(zhì)粒上T-DNA可插入植物基因組引發(fā)植物細(xì)胞改變。因?yàn)門-DNA轉(zhuǎn)移頻率很高,而且Ti質(zhì)粒上可插入幾百至幾千個(gè)堿基大小DNA片段,所以能夠利用這種天然遺傳轉(zhuǎn)化體系,將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。(2)優(yōu)點(diǎn):轉(zhuǎn)化頻率高、成本低、操作簡(jiǎn)單,而且轉(zhuǎn)基因后代

遺傳組成比較輕易分析。5.基因槍法把細(xì)胞看成靶子,用基因槍裝上帶有目標(biāo)基因微彈,對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行轟擊,目標(biāo)基因便像子彈一樣,伴隨基因槍強(qiáng)烈轟擊,進(jìn)入到受體細(xì)胞中。7/26一二三四四、目標(biāo)基因檢測(cè)與表示產(chǎn)物測(cè)定1.形態(tài)檢測(cè)(1)假如目標(biāo)基因表示產(chǎn)物含有顯著表型性狀,那么,能夠依據(jù)目標(biāo)性狀有沒(méi)有來(lái)判斷目標(biāo)基因是否表示。(2)假如目標(biāo)基因產(chǎn)物沒(méi)有顯著表型,在構(gòu)建表示載體時(shí),通常把一個(gè)匯報(bào)基因與目標(biāo)基因連在一起,經(jīng)過(guò)檢測(cè)匯報(bào)基因表示情況,來(lái)檢測(cè)目標(biāo)基因表示;所用匯報(bào)基因通常是抗生素抗性基因或熒光標(biāo)識(shí)基因。經(jīng)過(guò)檢測(cè)受體細(xì)胞是否含有某種抗生素抗性,或是否含有某種熒光標(biāo)識(shí),來(lái)追蹤目標(biāo)基因表示情況。8/26一二三四2.分子檢測(cè)(1)PCR檢測(cè):依據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)引物,采取PCR技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增,假如能擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段,說(shuō)明目標(biāo)基因已整合到受體細(xì)胞中。(2)分子雜交檢測(cè):把目標(biāo)基因片段進(jìn)行放射性同位素標(biāo)識(shí)或進(jìn)行生物素?zé)晒鈽?biāo)識(shí),用標(biāo)識(shí)好基因片段作探針,與受體生物基因組DNA進(jìn)行雜交,假如有雜交斑點(diǎn),依據(jù)分子雜交基本原理,說(shuō)明目標(biāo)基因與受體細(xì)胞基因組DNA含有同源性,也就是說(shuō)目標(biāo)基因已經(jīng)被導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi),反之,則說(shuō)明目標(biāo)基因沒(méi)有進(jìn)入受體細(xì)胞中。(3)目標(biāo)基因是否表示檢測(cè):提取目標(biāo)基因mRNA,檢測(cè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄情況;分離目標(biāo)基因編碼蛋白質(zhì),檢測(cè)目標(biāo)基因表示情況。9/261.基因表示載體構(gòu)建(1)構(gòu)建過(guò)程(2)構(gòu)建目標(biāo):使目標(biāo)基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,而且能夠遺傳給下一代,同時(shí),使目標(biāo)基因能夠表示和發(fā)揮作用。10/26

尤其提醒終止子是指DNA分子上決定轉(zhuǎn)錄終止一段核苷酸序列;終止密碼子是指mRNA分子上決定翻譯終止三個(gè)相鄰堿基。11/262.將目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞慣用方法比較12/263.目標(biāo)基因檢測(cè)與判定過(guò)程

13/26題型一題型二題型三題型四基因工程技術(shù)操作【典例1】

天然玫瑰沒(méi)有藍(lán)色花,這是因?yàn)槿狈刂扑{(lán)色色素合成基因B,而開(kāi)藍(lán)色花矮牽牛中存在序列已知基因B。現(xiàn)用基因工程技術(shù)培育藍(lán)玫瑰,以下操作正確是(

)A.提取矮牽牛藍(lán)色花mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄取得互補(bǔ)DNA,再擴(kuò)增基因BB.利用限制性內(nèi)切酶從開(kāi)藍(lán)色花矮牽?；蚪M中獲取基因BC.利用DNA聚合酶將基因B與質(zhì)粒連接后導(dǎo)入玫瑰細(xì)胞D.將基因B直接導(dǎo)入大腸桿菌,然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細(xì)胞14/26題型一題型二題型三題型四解析:由題意知,控制藍(lán)色色素合成基因B是目標(biāo)基因,提取矮牽牛藍(lán)色花mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄取得互補(bǔ)DNA,再擴(kuò)增基因B,即得到目標(biāo)基因B,A項(xiàng)正確。限制性內(nèi)切酶是將某DNA分子上目標(biāo)基因切割下來(lái),而不是獲取目標(biāo)基因,B項(xiàng)不正確。將目標(biāo)基因B與質(zhì)粒連接需用DNA連接酶,而不是DNA聚合酶,C項(xiàng)不正確?；駼需與質(zhì)粒連接形成基因表示載體再導(dǎo)入農(nóng)桿菌,然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細(xì)胞,而不能將基因B直接導(dǎo)入大腸桿菌,D項(xiàng)不正確。答案:A15/26題型一題型二題型三題型四基因表示載體構(gòu)建【典例2】

以下相關(guān)基因表示載體構(gòu)建說(shuō)法,不正確是(

)A.需要限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶參加B.基因表示載體中含有開(kāi)啟子和終止密碼子C.通慣用抗生素抗性基因作為匯報(bào)基因D.基因表示載體構(gòu)建是基因工程關(guān)鍵解析:基因表示載體構(gòu)建關(guān)系到目標(biāo)基因在受體細(xì)胞中能否表示,是基因工程關(guān)鍵。基因表示載體構(gòu)建需要限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶參加,它結(jié)構(gòu)由目標(biāo)基因、開(kāi)啟子、終止子、標(biāo)識(shí)基因等組成。終止密碼子是指位于mRNA上不編碼氨基酸三個(gè)相鄰堿基,是翻譯結(jié)束位點(diǎn),而終止子是位于DNA上三個(gè)相鄰堿基,它是轉(zhuǎn)錄結(jié)束位點(diǎn)。答案:B16/26題型一題型二題型三題型四反思領(lǐng)悟表示載體是在原始載體(如天然質(zhì)粒)基礎(chǔ)上,插入表示系統(tǒng),如開(kāi)啟子、終止子和標(biāo)識(shí)基因等,使其在受體細(xì)胞內(nèi)既易于表示又易于檢測(cè)。17/26題型一題型二題型三題型四目標(biāo)基因?qū)搿镜淅?】

采取基因工程方法培育抗蟲(chóng)棉,以下導(dǎo)入目標(biāo)基因做法正確是(

)①將毒素蛋白注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白DNA序列,注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白DNA序列與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入細(xì)菌,用該細(xì)菌感染棉體細(xì)胞,再進(jìn)行組織培養(yǎng)④將編碼毒素蛋白DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組,并配制成一定濃度溶液,然后涂抹人工授粉后棉花柱頭A.①②

B.②③

C.③④

D.①④18/26題型一題型二題型三題型四解析:將目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí),要經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶將目標(biāo)基因和運(yùn)載體結(jié)合起來(lái),然后導(dǎo)入受體細(xì)胞。將毒素蛋白直接注射到棉受精卵中,沒(méi)有取得目標(biāo)基因,子代細(xì)胞不會(huì)有抗蟲(chóng)性狀。將編碼毒素蛋白DNA序列注射到棉受精卵中而沒(méi)有將目標(biāo)基因與運(yùn)載體結(jié)合,這么目標(biāo)基因在細(xì)胞內(nèi)很輕易被水解,不能保留下來(lái),更不能表示。答案:C19/26題型一題型二題型三題型四目標(biāo)基因檢測(cè)與表示產(chǎn)物測(cè)定【典例4】

利用當(dāng)代生物技術(shù),將蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因整合到棉花細(xì)胞中,為檢測(cè)試驗(yàn)是否成功,最方便方法是檢測(cè)棉花植株是否有(

)A.抗蟲(chóng)基因

B.抗蟲(chóng)基因產(chǎn)物C.新細(xì)胞核

D.對(duì)應(yīng)抗蟲(chóng)性狀解析:對(duì)目標(biāo)基因檢測(cè)有形態(tài)檢測(cè)和分子檢測(cè)。相對(duì)來(lái)說(shuō)分子檢測(cè)操作難度大,而形態(tài)檢測(cè)直觀且簡(jiǎn)單,如用棉花葉片飼喂棉鈴蟲(chóng),觀察棉鈴蟲(chóng)是否死亡即可。答案:D20/26123451.在用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗除草劑轉(zhuǎn)基因煙草過(guò)程中,以下操作錯(cuò)誤是(

)A.用限制性內(nèi)切酶切割煙草花葉病毒核酸B.用DNA連接酶連接經(jīng)切割抗除草劑基因和運(yùn)載體C.將重組DNA分子導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體D.用含除草劑培養(yǎng)基篩選抗除草劑轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞解析:構(gòu)建重組DNA分子時(shí),需用限制性內(nèi)切酶切割目標(biāo)基因和運(yùn)載體,再用DNA連接酶連接形成重組DNA分子。煙草花葉病毒遺傳物質(zhì)是RNA,限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別和切割有特定序列DNA分子,同時(shí)該過(guò)程目標(biāo)基因是抗除草劑基因,A項(xiàng)錯(cuò)誤。答案:A21/26123452.以下不屬于目標(biāo)基因與運(yùn)載體結(jié)合過(guò)程是(

)A.用一定限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒露出黏性末端B.用同種限制性內(nèi)切酶切割目標(biāo)基因露出黏性末端C.將切下目標(biāo)基因片段插入質(zhì)粒切口處D.將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增解析:將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,是在完成目標(biāo)基因與運(yùn)載體結(jié)合過(guò)程之后。答案:D22/26123453.目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞后,是否能夠穩(wěn)定維持和表示其遺傳特征,只有經(jīng)過(guò)判定和檢測(cè)才能知道。以下屬于目標(biāo)基因檢測(cè)和判定是(

)①檢測(cè)受體細(xì)胞內(nèi)是否有目標(biāo)基因②檢測(cè)受體細(xì)胞是否有質(zhì)粒③檢測(cè)目標(biāo)基因是否轉(zhuǎn)錄形成mRNA

④檢測(cè)目標(biāo)基因是否翻譯成蛋白質(zhì)A.①②③ B.②③④C.①③④ D.①②④解析:目標(biāo)基因檢測(cè)與表示產(chǎn)物測(cè)定有分子水平上檢測(cè),如目標(biāo)基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,目標(biāo)基因是否轉(zhuǎn)錄形成

mRNA,目標(biāo)基因是否翻譯成蛋白質(zhì);還有個(gè)體水平上對(duì)應(yīng)性狀判定,如抗蟲(chóng)、抗病性狀等。不過(guò)受體細(xì)胞內(nèi)有質(zhì)粒不代表一定有目標(biāo)基因。答案:C23/26123454.以下普通不作為基因工程中匯報(bào)基因是(

)A.四環(huán)素抗性基因B.綠色熒光蛋白基因C.產(chǎn)物含有顏色反應(yīng)基因D.貯藏蛋白基因解析:匯報(bào)基因位于運(yùn)載體(質(zhì)粒)上,通慣用于檢測(cè)目標(biāo)基因表示情況,如四環(huán)素抗性基因、綠色熒光蛋白基因、產(chǎn)物含有顏色反應(yīng)基因等。答案:D24/26123455.科學(xué)家利用基因工程技術(shù)能夠使哺乳動(dòng)物本身變成“批量生產(chǎn)藥品工廠”