1DBXX/XXXXX—XXXX種雞禽白血病凈化技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了種雞群禽白血病凈化檢測和凈化狀態(tài)維持相關(guān)的技術(shù)規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)所列種雞各生長階段凈化檢測技術(shù)主要適用于有禽白血病凈化需求的原種雞群（或稱核心群其他類型雞群也可參照執(zhí)行。所列禽白血病凈化狀態(tài)維持技術(shù)適用于已實現(xiàn)禽白血病凈化的雞群。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18635動物防疫基本術(shù)語GB/T26436禽白血病診斷技術(shù)NY/T680禽白血病病毒p27抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗方法《中國獸藥典》3術(shù)語和定義3.1種雞breedingchicken經(jīng)過不斷選種、選育，按育種組織制訂的文件鑒定承認(rèn)的雞品種。根據(jù)其經(jīng)濟(jì)用途，分為蛋雞系和肉雞系。3.2原種雞群pedigreebreederflock按照四系配套原則，雞的遺傳譜系分為曾祖代、祖代、父母代、商品代，只有曾祖代的雞可以自繁留種，其他后代都不能留做和它同級的種，通常將曾祖代稱為原種雞群或者核心群。3.3禽白血病（Avianleukosis,AL）和禽白血病病毒（Avianleukosisvirus,ALV）禽白血病(Avianleukosis,AL)是由禽白血病/肉瘤病毒群病毒(Avianleukosisvirus,ALV)引起的以造血細(xì)胞惡性增生為主的禽類多種腫瘤性疾病的總稱。禽白血病的特點(diǎn)是呈漸進(jìn)性發(fā)生和持續(xù)性死亡。禽白血病病毒感染雞群后，導(dǎo)致雞群生產(chǎn)性能下降，免疫失敗，死淘率增加，尤其是產(chǎn)蛋率和蛋的品質(zhì)下降，雞苗的品質(zhì)下降等。ALV既可通過種蛋垂直感染，也可以水平傳播，因此該病一直是種雞和蛋雞生產(chǎn)中危害嚴(yán)重的疫病。禽白血病病毒(Avianluekosisvirus,ALV)歸屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科反轉(zhuǎn)錄病毒屬。病毒粒子為一直徑為80～120nm，平均是90nm的球狀物，其外周是囊膜糖蛋白，其中g(shù)p852DBXX/XXXXX—XXXX基因是囊膜蛋白表面的主要成分，主要決定了病毒亞群的特性，內(nèi)部病毒子核心有一主要的群特異性抗原p27蛋白，其為核衣殼蛋白，主要用于群特異性抗原的檢測。3.4動物疫病凈化animaldiseaseeradication在特定區(qū)域或場所對某種或某些重要動物疫病有計劃的通過監(jiān)測、檢驗檢疫、隔離、撲殺、生物安全等一系列綜合措施，最終達(dá)到在該范圍內(nèi)動物個體不發(fā)病和無感染狀態(tài)的根除消滅疫病病原的過程，目的是消滅或清除傳染源，從而達(dá)到并維持動物個體和群體健康。這個特定區(qū)域或場所是人為確定的一個固定范圍，可以是一個養(yǎng)殖場、一個自然區(qū)域、一個行政區(qū)，也可以是一個國家。本文件所指凈化主要指在種雞群中（通常為一個種雞場通過雛雞胎糞檢測、不同日齡雞血液病毒分離、公雞精液中病毒分離等方法，發(fā)現(xiàn)并淘汰雞群中感染禽白血病的雞只，最終達(dá)到雞群消除該病的過程。4凈化檢測程序4.1出殼雛雞胎糞檢測與淘汰4.1.1將種蛋置于出殼紙袋（紙盒）中隔離孵化，每只種雞所產(chǎn)種蛋單獨(dú)使用一個出殼紙袋（紙盒以免出雛時發(fā)生橫向傳播。4.1.2出殼后將雛雞胎糞擠壓于滅菌的2mL離心管中，離心管中預(yù)先加入0.6mL樣品稀釋液（商品化試劑盒中專用稀釋液充分震蕩混勻。對每只雛雞采集完胎糞后，要更換一次性手套或?qū)﹄p手酒精消毒，然后再采集下一只雛雞的胎糞。4.1.3將雛雞胎糞樣品置入液氮中快速冷凍后取出，放入25～37℃水浴中融化，反復(fù)凍融三次，離心，取上清液用于檢測胎糞中禽白血病病毒p27抗原。4.1.4禽白血病病毒p27抗原檢測，可按照NY/T680文件或采用等效的商品化酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒進(jìn)行，也可采用針對禽白血病病毒p27抗原的單克隆抗體建立的膠體金試紙條等快速檢測方法。4.1.5同一只母雞所產(chǎn)的雛雞中，若有一只雛雞胎糞檢測為禽白血病病毒p27抗原陽性，則該紙袋（紙盒）中所有雛雞視為陽性，相應(yīng)雛雞及其對應(yīng)母雞應(yīng)全部淘汰。4.1.6陰性雞作為育種選留進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，來源于同一母雞的陰性雛雞放于同一籠中。在育雛期間每個籠具之間應(yīng)采取阻隔措施以避免水平傳播。為避免籠間直接接觸和直接氣流的對流，可在每個籠具之間用紙板阻隔，在不影響通風(fēng)的情況下紙板高度應(yīng)盡量高。4.2開產(chǎn)初期的檢測與淘汰4.2.1每只母雞取開產(chǎn)后的初產(chǎn)蛋2～3枚采集蛋清，蛋清反復(fù)凍融三次，按照4.1.4規(guī)定方法逐個檢測禽白血病病毒p27抗原。也可無菌采集母雞抗凝血，按照GB/T26436規(guī)定方法接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，培養(yǎng)7～9d后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照4.1.4規(guī)定方法檢測禽白血病病毒p27抗原。4.2.2公雞分別采集抗凝血和精液同時接種DF-1細(xì)胞，按照4.2.1規(guī)定方法進(jìn)行禽白血病病毒分離鑒定。精液病毒分離鑒定具體操作見附錄A。也可無菌采集血清、精液或肛拭子進(jìn)行PCR-HRM檢測。4.2.3檢測為陽性的雞應(yīng)淘汰，不再作為育種選育個體。對檢測為陰性的選留后備種雞，繼續(xù)維持小群隔離飼養(yǎng)。3DBXX/XXXXX—XXXX4.3留種前的檢測與淘汰4.3.1取每只母雞所產(chǎn)種蛋2～3枚采集蛋清，檢測方法同4.2.1。4.3.2公雞檢測方法同4.2.2。4.3.3檢測為陽性的雞應(yīng)淘汰，不再作為育種選育個體。對檢測為陰性的選留后備種雞，繼續(xù)維持小群隔離飼養(yǎng)。4.4種蛋的選留和孵化按照本文件4.1～4.3規(guī)定程序淘汰所有陽性雞后，每只母雞僅選用1只檢測為陰性公雞的精液進(jìn)行人工授精。按育種規(guī)定時間留足種蛋，每只母雞的種蛋均標(biāo)號。將每只母雞的種蛋置于寫有該母雞標(biāo)號的專用孵化紙袋（紙盒）中，防止不同母雞的種蛋直接接觸，置于出雛箱中出雛。4.5不同世代的持續(xù)檢測經(jīng)檢測合格的種蛋孵出的雛雞作為凈化后第二世代雞，繼續(xù)按照本文件4.1～4.4規(guī)定的程序?qū)嵤┑诙来臋z測和凈化。后續(xù)世代按此程序繼續(xù)循環(huán)進(jìn)行，直至評估達(dá)到附錄B所列禽白血病凈化評估標(biāo)準(zhǔn)。5凈化周期與終止5.1凈化周期確定凈化時可根據(jù)種雞所處育種時期，對照本文件4.1～4.4的任何一個時間節(jié)點(diǎn)啟動凈化程序。不同種雞場可根據(jù)其技術(shù)條件分別選擇本文件4.1～4.4的任何一時間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行檢測，但按照本文件4.1～4.4從出殼開始至留種過程中所有時間節(jié)點(diǎn)全部進(jìn)行檢測是實現(xiàn)凈化的最短周期。5.2凈化效果評估凈化效果評估應(yīng)按照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)行政主管部門制定的禽白血病凈化評估程序和凈化評估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。凈化評估標(biāo)準(zhǔn)見附錄B。5.3達(dá)到凈化雞群的檢測比例調(diào)整對按照5.2評估達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)的原種場無需再按照本文件4.1～4.4要求進(jìn)行普遍性檢測，可按照5.2或不低于10%的比例進(jìn)行抽樣監(jiān)測。檢測結(jié)果不符合5.2所要求標(biāo)準(zhǔn)，則按照本文件4.1～4.4所列檢測規(guī)程重新進(jìn)入檢測凈化程序。6已凈化雞群的凈化狀態(tài)維持措施6.1種源的選擇對飼養(yǎng)進(jìn)口祖代及其以下代次的雞場，應(yīng)從無外源性禽白血病病毒感染的育種公司購入雞苗。應(yīng)要求供應(yīng)商提供初產(chǎn)種蛋(100～200枚)，檢測蛋清中p27抗原為陰性。同時，可要求供應(yīng)商提供相關(guān)種4DBXX/XXXXX—XXXX雞群在相應(yīng)年齡（23周齡后）的禽白血病病毒血清抗體檢測報告和留種孵化前所產(chǎn)種蛋的蛋清p27抗原檢測報告。6.2禽白血病凈化維持監(jiān)測種雞群在飼養(yǎng)過程中應(yīng)進(jìn)行禽白血病定期監(jiān)測，以了解雞群禽白血病病毒的感染狀態(tài)?？稍诜N雞群開產(chǎn)后、留種蛋前，采集500份左右血清樣品，用ELISA方法檢測禽白血病病毒A/B亞群及J亞群抗體。同時，采集種蛋用ELISA方法檢測蛋清中的禽白血病p27抗原。如果血清抗體陽性率或蛋清p27抗原陽性率超過1%時，應(yīng)對雞群采集抗凝血接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒分離鑒定或采集血清或肛拭子進(jìn)行PCR-HRM檢測。6.3種雞場生物安全措施種雞場應(yīng)執(zhí)行全進(jìn)全出制度。飼養(yǎng)已經(jīng)凈化的品系時，應(yīng)避免不同來源的種雞在同一雞場飼養(yǎng)而發(fā)生交叉感染。一個雞場在同一時期只能飼養(yǎng)同一批來源的種雞。不同來源的種蛋在孵化和出雛之時應(yīng)分開，避免與其他雞群（特別是非凈化雞群）同時孵化和出殼，以減少禽白血病水平傳播風(fēng)險。種雞場地理位置應(yīng)相對隔離，遠(yuǎn)離其他雞場。運(yùn)送物品車輛以及人員出入，均應(yīng)執(zhí)行消毒制度，同時應(yīng)盡可能降低種雞場所需物品與外界的交流。接觸核心群的工作人員應(yīng)固定化，避免其他雞群的飼養(yǎng)員進(jìn)入實施凈化的雞群中工作。種雞場應(yīng)在雞舍安裝防鳥網(wǎng)或其他防鳥設(shè)施，并定期檢查維護(hù)。6.4疫苗的管理和使用凈化雞群使用的針對各種雞病的弱毒疫苗，應(yīng)是經(jīng)過《中國獸藥典》規(guī)定程序檢測合格的疫苗，確保無外源性禽白血病毒污染。用雞胚或雞胚來源的細(xì)胞作為原材料生產(chǎn)的疫苗，以及對1日齡雛雞通過注射法（包括皮膚刺種）使用的疫苗，使用前應(yīng)進(jìn)行檢測。雞用弱毒活疫苗中禽白血病病毒污染檢測操作程序可參考附錄C。5DBXX/XXXXX—XXXX附錄A（規(guī)范性附錄）ALV的分離和分離培養(yǎng)物的檢測A.1分離病毒用細(xì)胞在分離外源性ALV時，考慮到E亞型的內(nèi)源ALV的干擾，必須選用C/E細(xì)胞對內(nèi)源性ALV-E有抵抗力的細(xì)胞，如0系SPF的雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）或來自0系雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）的傳代細(xì)胞系DF-1細(xì)胞。如果不使用C/E細(xì)胞來分離培養(yǎng)ALV就不能排除內(nèi)源性ALV-E的干擾，就不能得出分離到外源性ALV的結(jié)論。A.2樣品采集和處理A.2.1血漿p27抗原檢測陽性率降低到1%以下時，選取400～600只雞的小群，全群無菌采集抗凝血（用肝素鈉做抗凝劑），1500rpm離心15分鐘后，取上清接種于DF-1細(xì)胞。A.2.2精液使用75%乙醇將泄殖腔周圍擦拭干凈，將公雞精液采集到1.5mL已滅菌的離心管中，一只公雞的精液對應(yīng)一個離心管，編號后放入冰盒中暫存。采集的精液，用含有青鏈霉素（青霉素100U/mL，鏈霉素0.1mg/mL）的細(xì)胞維持液，按照最終稀釋度為1:28～1:56充分混勻后接種DF-1細(xì)胞。A.2.3疑似ALV污染的活疫苗檢測例如，馬立克氏病細(xì)胞結(jié)合疫苗從液氮中取出后，在含有疫苗的細(xì)胞懸液中加入9～10倍的滅菌注射用水，將細(xì)胞懸液移至小試管混勻，4℃放置10分鐘讓細(xì)胞在低滲下裂解死亡然后接種于DF-1細(xì)胞。A.3病毒接種細(xì)胞的方法本規(guī)定推薦使用來自0系CEF的傳代細(xì)胞系DF-1。A.3.1在37℃水浴中提前預(yù)熱消化液（0.25%胰酶）和DMEMhigh-glucose。。A.3.2棄去細(xì)胞瓶中長滿的細(xì)胞培養(yǎng)液上清。A.3.3加入PBS清洗兩遍后，25cm2的培養(yǎng)瓶中加入5ml胰酶。在加入胰酶2分鐘后消化完全，再加入10mL的細(xì)胞培養(yǎng)液含有10%FBS的DMEM。A.3.41200rpm離心5分鐘后棄去上清，加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液使細(xì)胞濃度達(dá)到1×104～2×104個細(xì)胞。A.3.5將細(xì)胞懸液加入到24孔板中，每孔0.5mL，培養(yǎng)24～36h后待細(xì)胞長滿。A.3.6每孔加入分離好的50ul血漿樣品以及陰陽性對照。6DBXX/XXXXX—XXXXA.3.7于細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃5%CO2中培養(yǎng)細(xì)胞24h。A.3.824h后將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為細(xì)胞維持液含有2%FBS的DMEM培養(yǎng)7d～9d。A.3.97～9d后將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，最后一次凍融后，收集每一個樣品培養(yǎng)物。7DBXX/XXXXX—XXXX（資料性附錄）《動物疫病凈化示范場評估標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（2017版）中有關(guān)禽白血病凈化評估標(biāo)準(zhǔn)B.1凈化評估標(biāo)準(zhǔn)（同時滿足以下要求，視為達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)）B.1.1種雞群抽檢，禽白血病病原學(xué)檢測均為陰性；B.1.2連續(xù)兩年以上無臨床病例；B.1.3現(xiàn)場綜合審查通過。B.2抽檢要求表B.1凈化評估抽樣檢測方法檢測項目檢測方法抽樣總?cè)撼闃訑?shù)量樣本類型病原學(xué)檢測p27ELISA檢測產(chǎn)蛋雞群500枚種蛋（隨機(jī)抽樣，覆蓋不同棟雞群）種蛋病原分離（DF-1細(xì)胞）種雞群單系50份（隨機(jī)抽樣，覆蓋不同棟雞群）血樣注：p27抗原檢測全部為陰性，實驗室檢測通過；p27抗原檢測陽性率高于1%，實驗室檢測不通過。檢出p27抗原陽性且陽性率1%以內(nèi)，采用病毒分離進(jìn)行復(fù)測，病毒分離全部為陰性，實驗室檢測通過；病毒分離出現(xiàn)陽性，實驗室檢測不通過。8DBXX/XXXXX—XXXX（規(guī)范性附錄）PCR-HRM檢測ALV-JC.1引物序列C.1.1上游引物：CAGGAAACGTGTGGGTCACCC.1.2下游引物：TTATTGGACTTACCATCGC.2實驗步驟：C.2.1從樣品中提取病毒RNAC.2.1.1樣品中加入TRIZOL后反復(fù)吹打幾次，使樣品充分裂解。室溫放置5分鐘。C.2.1.2向以上溶液中加入氯仿，每使用1mLTRIZOL加入0.2mL氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15秒，室溫放置2～3分鐘。C.2.1.34℃12000rpm離心15分鐘，此時樣品分成三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無色水相，RNA主要在水相中，把水相（約600uL）轉(zhuǎn)移到一個新的RNase-Free離心管中。C.2.1.4在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置