毒理學(xué)知識(shí)總結(jié)一、肝臟生化檢查

通過(guò)化學(xué)分析和生物化學(xué)的方法，可觀察肝臟中某些成分及其含量的變化，從而弄清肝臟損害情況及可能機(jī)制。

（1）肝細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分變化

肝脂肪含量肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中脂質(zhì)含量變化反映某些肝臟損害的程度。對(duì)某些能引起脂肪肝而很少引起壞死的肝臟毒物（硫氨酸、磷等），測(cè)定肝組織中三酰甘油含量，常比血清酶檢查更敏感，并常常呈量一效關(guān)系。

糖原某些化學(xué)致癌物，在染毒早期可使肝組織內(nèi)糖原發(fā)生顯著變化。

酶和輔酶的測(cè)定大多數(shù)情況下，肝臟中酶活力的變化對(duì)確定肝臟損害意義不大。但某些具有特異性的酶，如G-6-P（葡萄糖-6-磷酸酶），ACP（酸性磷酸酶）和OCT（鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶）分別來(lái)自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和線粒體，其活性改變對(duì)于肝臟毒物的毒性評(píng)價(jià)及機(jī)制研究可提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。很多肝臟毒物還可引起肝臟GSH、ATP、NADPH等含量減少。

脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化與某些肝損害有關(guān)。如CCl4染毒后，不飽和脂肪酸含量減少，飽和脂肪增多，共軛二烯、丙二醛增加，就是其證據(jù)。

（2）常用的反映肝功能的生化檢查

①藥物代謝試驗(yàn)因藥物和其他外源性化學(xué)物質(zhì)的代謝主要經(jīng)肝微粒體酶催化，故肝臟對(duì)它們的代謝能力可用來(lái)作為肝損害程度的指標(biāo)。常用巴比妥類(lèi)藥物引起睡眠時(shí)間的長(zhǎng)短反映肝臟受損害的程度。具體做法是將一定劑量的巴比妥類(lèi)藥物物（苯巴比妥、硫賁妥鈉、戊巴比妥均可）給予小鼠，觀察小鼠睡眠時(shí)間（從翻正反射消失到恢復(fù)所經(jīng)歷的時(shí)間），因這類(lèi)藥由肝臟微粒體酶催化代謝，而睡眠時(shí)間長(zhǎng)短與肝損害程度呈相關(guān)性，肝臟損害嚴(yán)重者，睡眠時(shí)間延長(zhǎng)。

②染料排泄試驗(yàn)染料排泄試驗(yàn)可反映肝細(xì)胞在攝取、貯存、結(jié)合、排泄入膽汁各階段的功能。常用的染料有磺溴酞（BSP）和靛青綠（ICG）。

③血清酶學(xué)檢查是目前廣泛使用的，較為敏感的檢査肝損害的重要方法，被稱作肝毒性的生物標(biāo)記。其基本原理在于肝損害時(shí)，酶由細(xì)胞內(nèi)大量釋放入血。

各種血清酶在不同類(lèi)型肝損害時(shí)敏感性并不一致，可以分為四類(lèi)：第一類(lèi)主要反映膽汁淤積性損害。此類(lèi)酶有：堿性磷酸酶（AKP）、5＇-核苷酸酶（5′-NT）、亮氨酸氨肽酶（LAP）、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GCT）。第二類(lèi)主要反映肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害。此類(lèi)酶有：天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、蘋(píng)果酸脫氫酶酶（MDH）、乳酸脫氫酶（LDH）、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶酶（ALD）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶晦（ALT）、異檸檬酸脫氫酶（ICDH）、谷氨酸脫氫酶（CDH）、鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（OCT）、山梨酸脫氫酶SDH）、乳酸脫酶同工酶區(qū)帶-5（LDH5）、果糖單磷酸醛縮酶（F-P-ALD）、精氨酸酶。第三類(lèi)主要反映肝外組織損害。此類(lèi)酶有：肌酸磷酸激酶（CPK）。第四類(lèi)酶反應(yīng)與前三種相反，肝損害時(shí)酶活性降低。此類(lèi)酶有：膽堿酯酶（CHE）。二、藥物腎毒性的主要機(jī)制

（一）細(xì)胞毒作用

腎毒性藥物可通過(guò)不同的機(jī)制，如產(chǎn)生自由基損傷線粒體功能，或影響溶酶體膜等，直接損傷腎小管細(xì)胞膜而造成腎損害。這種損害通常與藥物劑量有關(guān)。

（二）免疫損害

具有半抗原性的藥物與腎組織蛋白結(jié)合后作為全抗原，致敏腎組織而引起變態(tài)反應(yīng)（Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)或Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)），從而導(dǎo)致腎小球或腎小管的損害，這種損害與藥物劑量無(wú)關(guān)。

（三）降低腎血流量

非甾體抗炎藥能抑制腎臟前列腺素合成，降低腎血流量，影響腎功能，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致不可逆的腎毒性。如該類(lèi)藥物引起的腎乳頭壞死，可能和乳頭部位慢性缺血繼發(fā)腎血管收縮有關(guān)

（四）機(jī)械性損害

難溶解的藥物結(jié)晶，沉著在腎小管，引起腎損害。如磺胺結(jié)晶引起的血尿。第二節(jié)藥物對(duì)心血管系統(tǒng)的毒性作用及機(jī)制

心血管系統(tǒng)是多種藥物的毒性作用部位，藥通過(guò)直接作用于血管平滑肌或交感神經(jīng)，升高或降低外周阻力，導(dǎo)致血壓的改變；通過(guò)損傷血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的功能，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、組織液生成增多及水腫、甚至出血；通過(guò)改變生物化學(xué)通路能量代謝、心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能、電生理學(xué)及心肌收縮性，產(chǎn)生心臟毒性，最終表現(xiàn)為心排血量減少和外周組織灌注量降低。藥物心血管毒性作用的具體分子靶位包括:細(xì)胞膜表面受體與轉(zhuǎn)運(yùn)體、第二信使系統(tǒng)、離子通道、離子泵、酶等。在心血管部位神經(jīng)遞質(zhì)的釋放異常亦可影響心血管的功能而產(chǎn)生毒性作用。

一、血壓異常

（一）高血壓

一很多藥物能引起血壓的異常升高，使收縮壓大于140mmHg及舒張壓大于90mmHg，嚴(yán)重時(shí)造成血壓驟升，尤其是當(dāng)藥物引起交感神經(jīng)過(guò)度興奮或單胺類(lèi)遞質(zhì)釋放增加時(shí)，如腎上腺素受體激動(dòng)藥、單胺氧化酶抑制劑，劑量過(guò)大或快速靜脈注射可使血壓驟升。血壓過(guò)高使心室射血所遇的阻力過(guò)大，心肌后負(fù)荷過(guò)重，長(zhǎng)此以往，患者可能出現(xiàn)左心室代償性肥大、心臟擴(kuò)大甚至心衰。此外，血壓過(guò)高，血管壁也容易受損，如若累及腦血管，可發(fā)生腦出血。

人體的循環(huán)血量在神經(jīng)和體液因素的調(diào)節(jié)下是相對(duì)恒定的，然而，多種藥物可造成體液潴留、提高循環(huán)血量而影響血壓。血液主要由血細(xì)胞、血漿蛋白、水和電解質(zhì)等成分組成，其中水和電解質(zhì)是左右血量的最活躍的因素，其吸收與排出的動(dòng)態(tài)平衡維持著細(xì)胞內(nèi)外液的相對(duì)穩(wěn)定。激素類(lèi)藥物如潑尼松、地塞米松、甲睪酮或丙酸睪酮等，可引起水鈉潴留，導(dǎo)致循環(huán)血量增加而發(fā)生高血壓

除上述，某些降壓藥如中樞性降壓藥甲基多巴、胍乙啶，還有一些作用于外周受體的降壓藥如普萘洛爾，若長(zhǎng)期應(yīng)用后突停用，可引起高血壓，即反跳現(xiàn)象。一些作用于神經(jīng)節(jié)的降壓藥如美加明、米噻吩，若使用不當(dāng)也可引起同樣嚴(yán)重的后果。

（二）直立性低血壓

低血壓不同于高血壓，沒(méi)有明確的指征，藥物引起的低血壓大部分情況表現(xiàn)為一過(guò)性的直立性低血壓或稱體位性低血壓，多數(shù)抗高血壓藥物當(dāng)大劑量使用時(shí)，均可直接或間接地過(guò)度擴(kuò)張血管而產(chǎn)生直立性低血壓。血壓過(guò)低使組織缺血、缺氧，甚至?xí)炟?，有時(shí)還可導(dǎo)致反射性心跳加快，甚至心律失常。α受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）、硝基擴(kuò)血管藥物及具有外周α受體阻斷作用的其他類(lèi)別的藥物，如抗精神病藥、三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥、IA類(lèi)抗心律失常藥等，均易導(dǎo)致直立性低血壓。

二、血栓栓塞

血栓通常是因血管內(nèi)壁受損，致血小板黏著在受血管所暴露出來(lái)的膠原上并聚集起來(lái)，且在血小板黏著膠原的同時(shí)，受損血管所暴露的膠原組織或其他組織，可激活血漿內(nèi)的凝血因子，啟動(dòng)凝血過(guò)程，形成血栓。近年來(lái)，越來(lái)越多的文章報(bào)道，非甾體類(lèi)抗炎藥，尤其是高選擇性COX-2抑制劑，具有心血管系統(tǒng)毒性，它們可減少PGI2的合成，而PGI2可以阻礙血小板的聚集，加之，治療量的高選擇性COX-2抑制劑對(duì)COX-1沒(méi)有抑制作用，COX-1可以增加TAX2的合成，TAX2增加血小板的合成，它們因改變了TAX2/PGI2的比例而導(dǎo)致用藥者出現(xiàn)血栓栓塞傾向

三、心律失常

當(dāng)某些因素影響心肌細(xì)胞的自律性、興奮性和傳導(dǎo)性時(shí)，心臟搏動(dòng)就會(huì)失去正常規(guī)律而發(fā)生快速型或緩慢型心律失常，K+、Na+和Ca2+等離子在心臟的起搏與沖動(dòng)傳導(dǎo)中起著重要作用，某些藥物可直接影響心肌細(xì)胞的一種或多種離子通道，導(dǎo)致心肌田胞電生理特征發(fā)生變化，也可間接通過(guò)交感神和副交感神經(jīng)影響心臟電生理活動(dòng)以及干擾心臟的代謝

（一）快速型心律失常

竇性心動(dòng)過(guò)速、房性心動(dòng)過(guò)速、室性心動(dòng)過(guò)速、室顫、尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速等均屬快速型心律失常。其中，室顫和尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速是較危重的心律失常，當(dāng)藥物或毒物使心電圖的Q-T間期顯著延長(zhǎng)超過(guò)460ms（正常約300ms）時(shí)，便容易產(chǎn)生致死性的尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速，常致心性猝死。如奎尼丁和索他洛爾在作為抗心律失常藥物時(shí)，若用藥不當(dāng)反而可致心律失，尤其是有可能導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)型室性心律失常及室顫等嚴(yán)重的病癥。此外，洋地類(lèi)藥物中毒時(shí)也易造成心律失常，該類(lèi)藥物可因過(guò)度抑制Na+-K+-ATP酶，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞明顯失鉀，此為其對(duì)心肌細(xì)胞的直接毒性作用，還可通過(guò)影響交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)發(fā)揮間接的心臟毒性作用，因其毒性作用機(jī)制涉及多個(gè)方面，加之心臟各不同特化部位對(duì)該類(lèi)藥物的反應(yīng)各不相同，因此洋地黃類(lèi)藥物中毒可引起各種類(lèi)型的心律失常，包括室性早搏、二聯(lián)律、房性或室性心動(dòng)過(guò)速、房顫或室顫等。

（二）緩慢型心律失常

竇性心動(dòng)過(guò)緩、竇房傳導(dǎo)阻滯、心房?jī)?nèi)傳導(dǎo)阻滯、房室傳導(dǎo)阻滯等均屬此類(lèi)心律失常，嚴(yán)重的竇性停搏和病態(tài)竇房結(jié)綜合征是致死性緩慢型心律失常，藥物等因素若引起迷走神經(jīng)張力增大或竇房結(jié)障礙，在一段時(shí)間內(nèi)竇房結(jié)停止發(fā)放激動(dòng)，即可導(dǎo)致竇性停搏。Ⅳ類(lèi)抗心律失常藥物如維拉米，因拮抗血管平滑肌和心肌細(xì)胞上的鈣通道，導(dǎo)致低血壓，也可發(fā)生竇性心動(dòng)過(guò)緩、房室傳導(dǎo)阻滯。尤其是當(dāng)該類(lèi)藥物與β-受體阻滯劑合用時(shí)，兩類(lèi)藥物的負(fù)性肌力、負(fù)性頻率及負(fù)性傳導(dǎo)作用相加，可導(dǎo)致心肌收縮力減弱，甚至心室停搏。洋地黃類(lèi)藥物中毒時(shí)可直接抑制竇房結(jié)，使其自律性下降，還可使心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的有效不應(yīng)期延長(zhǎng)、傳導(dǎo)速度減慢，造成部分或完全性心臟傳導(dǎo)阻滯。

有些藥物或毒物急性中毒時(shí)可導(dǎo)致心臟驟停，表現(xiàn)為心室完全停止跳動(dòng)或心肌呈不規(guī)則亂顫，二者可單獨(dú)存在也可交替出現(xiàn)。這些藥物，有些是因?yàn)閷?duì)心肌的直接損害，有些是由于過(guò)強(qiáng)地刺激了迷走神經(jīng)，還有些是由于中毒后引起的一些繼發(fā)反應(yīng)。

四、心肌病

藥源性心肌病臨床表現(xiàn)大多為類(lèi)似擴(kuò)張性心肌病，個(gè)別藥物如兒茶酚胺類(lèi)，引起類(lèi)似于肥厚型心肌病。常見(jiàn)的引起心肌病的藥物不多，主要是某些抗腫瘤藥物和抗病原蟲(chóng)藥物。藥物引起心肌病的毒性機(jī)制較復(fù)雜，對(duì)心肌細(xì)胞的損害可以是直接的，也可以是間接的，還可因藥物中毒引起的一些繼發(fā)病癥如休克，水、電解質(zhì)代謝失衡等導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損。依米丁是茜草科吐根屬植物根中的主要生物堿，也稱吐根堿，臨床曾經(jīng)主要用于治療阿米巴病，但該藥毒副作用較嚴(yán)重，尤其是對(duì)心肌的直接損害作用，大大地限制了其應(yīng)用。大劑量依米丁可抑制心肌細(xì)胞的氧化磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常，從而引起心肌病變，病理檢查可心肌細(xì)胞濁腫變性。柔紅霉素和多柔比星等含蒽環(huán)類(lèi)結(jié)構(gòu)的抗腫瘤抗生素也具心臟毒性，發(fā)生毒副作用時(shí)，早期可出現(xiàn)各種心律失常，藥物蓄積量大時(shí)可致不可逆性心肌損害，甚至造成心力衰竭。該類(lèi)藥物可以螯合鐵離子并消耗NADPH，從而與細(xì)胞P450還原反應(yīng)，形成半醌自由基中間體，進(jìn)而產(chǎn)生超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥基自由基等，造成DNA、RNA及蛋白質(zhì)等重要的生物大分子物質(zhì)損傷，使心肌細(xì)胞變性、壞死

五、心力衰竭

直接造成心肌細(xì)胞死亡從而損害心臟，使心肌的舒縮功能下降以及心臟舒縮時(shí)所承受的負(fù)荷過(guò)大，是心力衰竭的基本病因。如阿霉素中毒可直接造成心肌細(xì)胞死亡，從而損害心肌的舒縮功能，臨床常以心衰為要表現(xiàn)。另外還有一些因素屬于心衰的誘因，是指在基本病因的基礎(chǔ)上誘發(fā)心力衰竭的一些因素，其中，快速型心律失常是藥物中毒引起心衰的常見(jiàn)誘因，因該因素一方面可使舒張期縮短，致冠脈血流不足甚至造成心肌缺血缺氧，另一方面可使心率加快，導(dǎo)致心肌耗氧量增加，最終造成心泵功能下降。如丙吡胺、普羅帕酮等抗心律失常藥物，當(dāng)過(guò)量中毒致心律失常時(shí)，可引起心力衰竭，盡管抗心律失常藥物致心衰的發(fā)生率并不太高，但也時(shí)有報(bào)道，且常易發(fā)生于原來(lái)即有心律失常病癥的患者身上。洋地黃類(lèi)藥物中毒時(shí)，不論是否出現(xiàn)心律失常均有可能誘發(fā)或加重心衰。負(fù)性肌力也是可導(dǎo)致心力衰竭的一類(lèi)藥物，如鈣拮抗劑維拉帕米、地爾硫草等，過(guò)量或中毒時(shí)它們可直接降低心泵功能，靜脈注射過(guò)快可發(fā)生心臟抑制，嚴(yán)重者可出現(xiàn)心衰。β受體阻斷劑能有效地抑制β受體激活所介導(dǎo)的心臟生理反應(yīng)，從而降低自律性、抑制心肌收縮力、減慢傳導(dǎo)速度，但大劑量時(shí)可致緩慢型心律失常，并可誘發(fā)心力衰竭。第三節(jié)藥物血液系統(tǒng)毒性評(píng)價(jià)與檢測(cè)

血液一般檢查通常針對(duì)血液中兩種主要有形成分（紅細(xì)胞和白細(xì)胞）進(jìn)行量與質(zhì)的化驗(yàn)檢查，包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量測(cè)定、白細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)、血小板計(jì)數(shù)等。近年來(lái)，多參數(shù)血液分析儀的應(yīng)用不增加了檢驗(yàn)結(jié)果的精確性，也為臨床診斷提供了更多的指標(biāo)。一次血液檢查可以獲得紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（Hb）、血細(xì)胞比容（Hct）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞體積分布寬度（RDW）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、血小板平均體積（MPV）、血小板比容（PCT）、血小板體積分布寬度（DW）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)骨髓細(xì)胞學(xué)涂片檢查，可以了解骨髓中細(xì)胞質(zhì)和量的變化。對(duì)于可能有氧化作用或能進(jìn)行氧化還原的物質(zhì)，還應(yīng)當(dāng)觀察MetHb和海因茨小體的形成。骨髓組織學(xué)分析包括骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分類(lèi)、細(xì)胞分化程度、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平等。

常規(guī)的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)方法本章不再贅述，其他幾種方法如下。

一、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

網(wǎng)織紅細(xì)胞由晚幼紅細(xì)胞脫核后但尚未完全成熟的紅細(xì)胞，胞漿內(nèi)尚有嗜堿性殘余物質(zhì)，細(xì)胞核已消失，外觀與成熟紅細(xì)胞區(qū)別。用煌焦油藍(lán)等染色后，胞質(zhì)中可見(jiàn)藍(lán)或藍(lán)綠色枝點(diǎn)狀甚至網(wǎng)織狀結(jié)構(gòu)。

外周血中大量網(wǎng)織紅細(xì)胞的異常出現(xiàn)（成人于紅細(xì)胞的2％）被稱為網(wǎng)織紅細(xì)胞增多癥，提示骨髓一種快速的補(bǔ)償增生加強(qiáng)。一般在紅細(xì)胞增高前，網(wǎng)織紅細(xì)胞先增多，因此其計(jì)數(shù)可反映紅細(xì)胞的增生情況。比如溶血性貧血時(shí)網(wǎng)織紅細(xì)胞常增加，而再生障礙性貧血時(shí)常減少。缺鐵性貧血鐵劑治療后，網(wǎng)織紅細(xì)胞可增加至15％～20％。惡性貧血患者經(jīng)葉酸、維生素B12等治療后，在紅細(xì)胞增加之前，網(wǎng)織紅細(xì)胞已增加。因此，網(wǎng)織紅細(xì)胞通常是骨髓紅細(xì)胞生成功能的指征，不僅有助于血液病的診斷，還能跟蹤觀察療效，調(diào)節(jié)藥物劑量。

二、血細(xì)胞比容和紅細(xì)胞指數(shù)

血液中紅細(xì)胞占的體積百分比稱作比容。血細(xì)胞比容是血液表觀黏度的重要決定因素，血液表觀黏度隨血細(xì)胞比容呈指數(shù)增加。血細(xì)胞比容的測(cè)定方法有溫氏法（Wintrobe）、微量毛細(xì)管法和微量電比容法。該指標(biāo)有助于分析許多血液流變學(xué)參數(shù)，如全血黏度、血液和凝血過(guò)程的黏性、彈性、血沉等。

在測(cè)定血細(xì)胞比容的同一標(biāo)本中，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和Hb含量測(cè)定，通過(guò)這三個(gè)數(shù)據(jù)可進(jìn)一步計(jì)算出MCV、MCH、MCHC。

（1）平均紅細(xì)胞體積（MCV）單位為飛升（fl），人正常值為85～93fl。

MCV＝每升血液中紅細(xì)胞體積/每升血液中紅細(xì)胞數(shù)

（2）平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）單位為皮克（pg），人正常值為26～34pg。

MCH＝每升血液中血紅蛋白含量/每升血液中紅細(xì)胞個(gè)數(shù)

（3）平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）單位為g/L，人正常值為310～370g/L。

MCHC＝每升血液中血紅蛋白含量/每升血液中紅細(xì)胞體積

通過(guò)MCV、MCH、MCHC值的變化可分析紅細(xì)胞的形態(tài)特征，有助于貧血的分類(lèi)和鑒別。MCV和MCH值增大時(shí)，提示為大細(xì)胞性貧血，例如缺乏維生素B12、葉酸，營(yíng)養(yǎng)性巨幼細(xì)胞性貧血，妊娠期巨幼細(xì)胞性貧血，惡性貧血等情況；MCV和MCH值減小時(shí)，提示為單純小細(xì)胞性貧血，例如由感染、中毒等病因引起的貧血；慢性失血及缺鐵時(shí)引起的小細(xì)胞低色素性貧血，則表現(xiàn)為MCV、MCH和MCHC值都減小。

三、中粒細(xì)胞功能檢測(cè)

（1）中性粒細(xì)胞儲(chǔ)備功能檢測(cè)

①潑尼松刺激試驗(yàn)潑尼松具有刺激骨髓中粒細(xì)胞由儲(chǔ)存池向外周血釋放的功能，服用潑尼松后外周血中性粒細(xì)胞應(yīng)有明顯增高。潑尼松試驗(yàn)可反映骨髓中性粒細(xì)胞的儲(chǔ)備功能，中性粒細(xì)胞減少者在服用潑尼松后周血中性粒細(xì)胞最高絕對(duì)值如大于20×109/L，表明中性粒細(xì)胞的生成和儲(chǔ)備正常，中性粒細(xì)胞的減少可能由于骨髓釋放障礙或其他因素所致。

②腎上腺素刺激試驗(yàn)白細(xì)胞（主要是中性粒細(xì)胞）進(jìn)入血流后，約半數(shù)黏附于血管壁，成為邊緣池的組成部分之一，此部分白細(xì)胞在外周白細(xì)胞計(jì)數(shù)中不能被反映出來(lái)。注射腎上腺素后血管收縮，黏附于血管壁上的粒細(xì)胞脫落，從邊緣池進(jìn)入循環(huán)池，致外周血粒細(xì)胞數(shù)增高。白細(xì)胞減少者如在射腎上腺素后外周血粒細(xì)胞上升值高于（1.5～2.0）×109/L，則表示血管壁白細(xì)胞黏附增多，稱之為“假性”粒細(xì)胞減少。

（2）中性粒細(xì)胞功能檢測(cè)

①粒細(xì)胞趨化、吞噬與殺菌功能試驗(yàn)成熟中性粒細(xì)胞具有趨化、吞噬和殺菌功能，發(fā)生缺陷時(shí)，即使其他細(xì)胞免疫與體液免疫功能正常，也可能發(fā)生嚴(yán)重的致命感染。趨化功能可用皮膚窗法、Borden小室法或瓊脂糖凝膠平板法檢測(cè)；吞噬與殺菌功能可用白色念珠菌法、硝基四氮唑藍(lán)（NBT還原法或化學(xué)發(fā)光測(cè)定法檢測(cè)；溶細(xì)胞法更能直接反映細(xì)胞殺菌的情況，通過(guò)計(jì)數(shù)瓊平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)計(jì)算殺菌率。

②白細(xì)胞黏附試驗(yàn)白細(xì)胞在體外具有黏附于玻璃及異物的功能，并認(rèn)為該功能與白細(xì)胞的殺菌和吞噬作用有關(guān)。將一定量的血液與一定表面積的玻璃接觸一定時(shí)間后，即有一定量的白細(xì)胞黏附于玻璃表面，測(cè)定與玻璃接觸前后白細(xì)胞數(shù)之差，可計(jì)算出白細(xì)胞黏附率。

四、血液細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)法

細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)是在血液細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)上，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的原理，應(yīng)用涂片染色的方法研究細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的性質(zhì)，包括種蛋白質(zhì)、酶類(lèi)、脂類(lèi)、糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽、核酸以及它們的代謝活動(dòng)、生理功能和病理變化。因而這種方法能在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上鑒別各種類(lèi)型的血細(xì)胞，可作為血液毒性分析和鑒定的重要方法和手段。

過(guò)氧化物酶染色、蘇丹黑B染色、糖原染色、酯酶染色、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶染色等有助于確定急性白血病的類(lèi)型；鐵染色有助于區(qū)別缺鐵性貧血與非缺鐵性貧血；堿性磷酸酶染色有助于鑒別慢性粒細(xì)胞白血病與類(lèi)白血病反應(yīng)，再生障礙性貧血與陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥，真性紅細(xì)胞增多癥與繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥等；酸性磷酸酶染色有助于急性淋巴細(xì)胞白血病的免疫學(xué)分型和鑒別Gaucher病與Niemann-Pick??；糖原染色有助于區(qū)分紅白血病與嚴(yán)重缺鐵性貧血、重型海洋性貧血及巨幼細(xì)胞貧血等其他紅細(xì)胞系統(tǒng)疾病。

五、血液放射性核素檢測(cè)法

放射性核素檢測(cè)是利用放射性核素（radionuclide）及其射線來(lái)進(jìn)行疾病的診斷和治療，其在血液學(xué)方面的應(yīng)用大致可分為放射性核素功能檢測(cè)，放射性核素形態(tài)顯像和放射性核素體外分析三方面。

（1）放射性核素功能檢測(cè)

放射性核素功能檢測(cè)需要使用特殊的放射性藥物，在血液學(xué)檢查中更需要用放射性核素標(biāo)記活體血液細(xì)胞作示蹤劑，利用特殊的放射性探測(cè)器，通過(guò)探頭在人體的指定部位或采集血液標(biāo)本，探測(cè)放射性藥物強(qiáng)度的變化或作連續(xù)的動(dòng)態(tài)記錄，繪成曲線，以了解血液細(xì)胞或相應(yīng)臟器的功能。在血液學(xué)檢測(cè)中，可進(jìn)行紅細(xì)胞容積、血漿容量、紅細(xì)胞壽命、紅細(xì)胞破壞部位和血小板壽命等多項(xiàng)檢測(cè)

（2）放射性核素形態(tài)顯像

各臟器的顯像，必須使用特殊的放射性藥物（radiopharmaceutical），利用藥物的特性參與機(jī)體的代謝，使待測(cè)器官或組織富集或缺損放射性，達(dá)到示蹤的目的。當(dāng)該藥物進(jìn)入體內(nèi)目的位后，即可在體外用專(zhuān)用的儀器（如掃描機(jī)、γ-照相機(jī)、發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層）等獲取核分布圖像。在血液學(xué)中常用的顯像有骨髓顯像、脾臟顯像、淋巴顯像和血管栓塞部位顯像等。

（3）放射性核素體外分析

放射性核素體外分析的基本原理是利用放射性標(biāo)記抗原（＊Ag）和待測(cè)抗原（Ag）與有限量抗體（Ab）之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而設(shè)計(jì)的。標(biāo)記抗原的放射性核素有兩類(lèi):一類(lèi)是常用的125I和57Co標(biāo)記，發(fā)射y射線，能直接測(cè)量另一類(lèi)是3H和14C標(biāo)記，發(fā)射β-射線，需用特殊的閃爍液做間接測(cè)量。在血液學(xué)方面應(yīng)用于葉酸、維生素B12、鐵蛋白（ferritin），、內(nèi)皮素（ET）、血栓烷B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1a（6-ket0-PG-F1a）、環(huán)腺苷酸、環(huán)鳥(niǎo)苷酸和超氧化物歧化酶（SOD）等方面的檢測(cè)。

第三節(jié)其他單次給藥毒性試驗(yàn)方法。

一、最大給藥量法

在實(shí)際工作中，對(duì)于毒性低的化合物可用最大給藥濃度和最大給藥容量單次或24小時(shí)內(nèi)數(shù)次給藥，觀察動(dòng)物出現(xiàn)的反應(yīng)。一般使用20只嚙齒類(lèi)動(dòng)物，連續(xù)觀察14，天如無(wú)死亡出現(xiàn)，則該劑量即為受試藥的最大給藥量。

二、固定劑量法

固定劑量法（fixed-doseprocedure）不以死亡作為觀察終點(diǎn)，而是以明顯的毒性體征作為終點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。選擇5mg/kg、50m/kg、500mg/kg和2000mg/kg四個(gè)固定劑量進(jìn)行試驗(yàn)，特殊情況下可增加5000mg/kg劑量組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物首選大鼠，給藥前禁食6～12小時(shí)，給受試物后再禁食3～4小時(shí)。采一次給藥的方式。一般首先用雌性動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試。根據(jù)受試物的有關(guān)資料，由上四個(gè)劑量中選擇一個(gè)作為初始劑量，通常用500mg/kg作初始劑量進(jìn)行預(yù)試，如無(wú)毒性反應(yīng)，則用2000mg/kg進(jìn)行預(yù)試，此劑量如無(wú)死亡發(fā)生即可結(jié)束預(yù)試。如初始劑量出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，即降低一個(gè)檔次的劑量進(jìn)行預(yù)試，如該動(dòng)物存活，就在此兩個(gè)固定劑量之間選擇一個(gè)中間劑量試驗(yàn)。每個(gè)劑量給一只動(dòng)物，預(yù)試一般不超過(guò)5只動(dòng)物。每個(gè)劑量試驗(yàn)之間至少應(yīng)間隔24小時(shí)。給受試物后的觀察期至少7天，如動(dòng)物的毒性反應(yīng)到第7天仍然存在，尚應(yīng)繼續(xù)觀察7天。在上述預(yù)試的基礎(chǔ)上進(jìn)行正式試驗(yàn)。每個(gè)劑量至少用10只動(dòng)物，雌雄各半。根據(jù)預(yù)試的結(jié)果，由前面所述的四種劑量中選擇一個(gè)可能產(chǎn)生明顯毒性但又不引起死亡的劑量進(jìn)行試驗(yàn)。固定劑量試驗(yàn)法所獲得的結(jié)果，參考表14-5標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表14-5固定劑量法試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)

劑量（mg/kg）

存活數(shù)＜100％

100％存活，毒性表現(xiàn)明顯

100％存活，無(wú)明顯中毒表現(xiàn)

5

高毒（verytoxic）（LD50≤25mg/kg）

有毒（toxic）（LD5025～200mg/kg

用50mg/kg試驗(yàn)

50

有毒或高毒，用5mg/kg進(jìn)行試驗(yàn)

有害（harmful）（LD50200～20000mg/kg）

用500mg/kg試驗(yàn)

500

有毒或有害，用50mg/kg試驗(yàn)

LD50＞2000mg/kg

用2000mg/kg試驗(yàn)

2000

該化合物無(wú)嚴(yán)重急性中毒的危險(xiǎn)性

三、上下法（階梯法，序貫法）

上下法（upanddownmethod）最大的特點(diǎn)是節(jié)省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，不但可以進(jìn)行毒性表現(xiàn)的觀察，還可以估算LD50及其可信限，適合于能引起動(dòng)物快速死亡的藥物，分為限度實(shí)驗(yàn)和主實(shí)驗(yàn)。

1．限度試驗(yàn)

主要用于有資料提示受試物可能沒(méi)有毒性的情況。該法是最多用5只動(dòng)物進(jìn)行的一個(gè)序列試驗(yàn)。試驗(yàn)劑量一般為2000mg/kg，特殊情況下也可使用5000mg/kg。

2．主試驗(yàn)

在相關(guān)毒性資料很少或缺乏時(shí)，或預(yù)期試物有毒性時(shí)，應(yīng)進(jìn)行主試驗(yàn)。預(yù)先設(shè)定一個(gè)給藥程序，在此程序中間隔至少48小時(shí)，每次給藥1只動(dòng)物。給藥間隔主要取決于毒性出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和毒性的嚴(yán)重程度。第一只動(dòng)物的給藥劑量低于LD50的最接近的估計(jì)值，如果該動(dòng)物存活，第二只動(dòng)物給予高一級(jí)劑量；如果第一只動(dòng)物死亡或出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，第二只動(dòng)物給予低一級(jí)劑量。

四、非嚙齒類(lèi)動(dòng)物的急性近似致死量及最大耐受量測(cè)定

近似致死量（approximatelethaldose，ALD）是介于最小致死量（minimumlethaldose，MLD）與最大非致死量（maximumnon-lethaldose，MNLD）之間的劑量，均屬于毒性的上限指標(biāo)，而最大耐受量從廣義的毒效應(yīng)來(lái)看，應(yīng)屬于毒性的下限指標(biāo)。在實(shí)際工作中，MLD、MNLD、ALD及MTD（最大耐受量）均可從嚙齒類(lèi)動(dòng)物單次給藥毒性量效（死亡）曲線上推算得到。我國(guó)藥政管理部門(mén)認(rèn)可的方法是以狗的單次給藥毒性試驗(yàn)來(lái)獲得這些數(shù)據(jù)，一般用6只健康的Beagle犬，年齡為6～8月齡。具體方法如下。

（1）根據(jù)嚙齒類(lèi)動(dòng)物單次給藥毒性的各參數(shù)、或可參照受試藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其他相關(guān)資料，加以適當(dāng)調(diào)整，估計(jì)對(duì)狗可能起單次給藥毒性和死亡的劑量范圍。

（2）按50％遞增法設(shè)計(jì)出含10～20個(gè)劑量的序列表。

（3）根據(jù)單次給藥毒性資料估計(jì)，由劑量序列表中找出可能的致死劑量范圍。在此范圍內(nèi)，每間隔一個(gè)劑量給一只動(dòng)物，給藥途徑應(yīng)至少包括臨床擬用途徑，用等容量不等濃度給藥法。

（4）從試驗(yàn)中得到最低致死劑量和最高非致死劑量，然后用兩者之間的劑量給一只動(dòng)物，此劑量即為近似致死劑量。未發(fā)現(xiàn)中毒表現(xiàn)的最高劑量即為最大耐受劑量。

五、累積劑量設(shè)計(jì)法（金字塔法）

非嚙齒類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行單次給藥毒性試驗(yàn)可采用累積劑量設(shè)計(jì)法（pyramidingdosagedesign）。經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要8只動(dòng)物，分為對(duì)照組和給藥組，每組4只動(dòng)物，雌雄各2只。劑量的設(shè)計(jì)可以是1mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、30mg/kg、100mg/kg、300mg/kg、1000mg/kg、3000mg/kg，也可以采用10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg、640mg/kg、1280m/kg，通常隔日給予下一個(gè)高劑量，劑量逐漸加大，直到出現(xiàn)動(dòng)物死亡時(shí)或達(dá)到劑量上限時(shí)止。

當(dāng)沒(méi)有動(dòng)物死亡時(shí)，MLD和LD50大于最高劑或限制劑量。當(dāng)在某一劑量所有動(dòng)物均出現(xiàn)死亡時(shí)，MLD和LD50應(yīng)在最后兩個(gè)劑量之間。當(dāng)在某一劑量部分動(dòng)物出現(xiàn)死亡，部分死亡出現(xiàn)在后繼的下一個(gè)高劑量，此時(shí)，MLD位于首次出現(xiàn)死亡的劑量和前低劑量之間，LD50則應(yīng)在首次出現(xiàn)動(dòng)物死亡的量和所有動(dòng)物均死亡的劑量之間。假如沒(méi)有動(dòng)物死亡發(fā)生，常常以最高劑量給予動(dòng)物5～7天，以確定后續(xù)的重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)中高劑量的選擇。三、多次用藥劑量水平的選擇

選擇合適的劑量水平可能是重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)中最為困難的任務(wù)。鑒于重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的基本目標(biāo)，三個(gè)劑量組是必不可少的：其中一個(gè)是足以引起明顯的或嚴(yán)重的毒性反應(yīng)的高劑量組，但又不能造成太多動(dòng)物中毒死亡，死亡率應(yīng)控制在10％以內(nèi)，第二個(gè)是不引起毒性作用的低劑量組，為表明毒性作用的量-效關(guān)系，在上述兩個(gè)劑量之間插入一個(gè)（或多個(gè)）中間劑量組。在實(shí)際操作中，要恰到好處的選擇到既出現(xiàn)毒性癥狀，又使死亡率不超過(guò)10％的高劑量是非常困難的。更為現(xiàn)實(shí)要求應(yīng)是在不造成過(guò)多動(dòng)物死亡的前提下，在高劑量組動(dòng)物中得到確切的毒性作用資料，低劑量原則上應(yīng)高于同種動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn)有效劑量或預(yù)期臨床治療劑量的等效劑量，并不使動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)。據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，低劑量如在預(yù)期臨床治療劑量的等效劑量3倍以上不出現(xiàn)毒性反應(yīng)的話，則此臨床用量基本上為安全劑量。

重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的最高劑量要求僅出現(xiàn)輕度毒性，而不改變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常壽命，或至少在給藥的前四分之一時(shí)間內(nèi)不影響動(dòng)物的體質(zhì)，外觀無(wú)異常，不過(guò)可以表現(xiàn)為血清酶活力的改變或輕度體重增長(zhǎng)抑制（不超過(guò)10％）；低劑量應(yīng)是完全無(wú)毒的。如在90天重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)，亦可用90天試驗(yàn)中體重增長(zhǎng)不到10％的劑量作為MTD（最大耐受劑量）。以此MTD為慢性試驗(yàn)的最大劑量，另外兩個(gè)劑量通常是1/4MTD和1/8MTD。重復(fù)給藥毒性與重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)二者的劑量關(guān)系如表15-4所示。

表15-4重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)

劑量組

劑量

高劑量

重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的高劑量與中劑量之中值

中劑量

重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)高劑量與低劑量之中值

低劑量

不低于高劑量的10％

在選擇合適的劑量時(shí)還應(yīng)考慮到：①供試藥物在體內(nèi)的生物蓄積作用。測(cè)定藥物在不同的組織、器官和體液中的半衰期，可為估計(jì)藥物在體內(nèi)的蓄積程度提供有價(jià)值信息；測(cè)定有關(guān)的蓄積參數(shù)，也可了解藥物的蓄積性。對(duì)于高蓄積性藥物應(yīng)適當(dāng)減少其劑量，否則在重復(fù)給藥試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各劑量均有可能出現(xiàn)毒性作用。②供試藥物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而這些酶又是否易被供試藥物本身所誘導(dǎo)或抑制。例如，某藥物如果抑制與其本身代謝解毒有關(guān)的酶，則該藥物的給藥劑量應(yīng)酌情減少。③供試物在消化道中的穩(wěn)定性與胃腸道內(nèi)容物有親和性的供試藥物，則應(yīng)酌情增加劑量，實(shí)際上在這種情況下應(yīng)考慮的是作為口服給藥是否合理的問(wèn)題。下面介紹幾種具體方法供參考。

（1）半數(shù)致死量法（LD50法）

根據(jù)單次給藥毒性的LD50值決定三個(gè)劑量。一般在大鼠3個(gè)月重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中，高、中、低三個(gè)劑量可分別采用約LD50的1/10、1/50和1/100劑量，狗各劑量組可采用大鼠應(yīng)各組的1/2～1/3劑量。此法為粗略估計(jì)，差異較大，一般只做預(yù)測(cè)的參考。當(dāng)急性毒性試驗(yàn)和重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)用的是同一種動(dòng)物時(shí)，參考價(jià)值相對(duì)大一些；反之，如LD50是小鼠的結(jié)果，則對(duì)長(zhǎng)毒的大鼠和狗來(lái)說(shuō)，因種屬差異而造成的誤差和風(fēng)險(xiǎn)將更大些。為了克服這一弊端，可先進(jìn)行過(guò)渡性短期試驗(yàn)，以了解受試物的蓄積性特征。

（2）短期蓄積試驗(yàn)過(guò)渡法

重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)存在著多次給藥的蓄積性作用，故單純地以幾分之幾的LD50作為劑量設(shè)計(jì)依據(jù)，則十分不可靠。所以如何將單次給藥試驗(yàn)的結(jié)果加以合理過(guò)渡，使之符合重復(fù)給藥試驗(yàn)規(guī)律是在劑量設(shè)計(jì)時(shí)首先應(yīng)重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。在獲得單次給藥毒性的有關(guān)資料后，應(yīng)根據(jù)其所提供的有關(guān)信息，如毒性的量效關(guān)系，毒性征出現(xiàn)的劑量范圍及敏感物等，先過(guò)渡到7～21天短期的蓄積性試驗(yàn)（圖15-1），初步將單次給藥毒性的參數(shù)外推于重復(fù)給藥試驗(yàn)。這種過(guò)渡性短期試驗(yàn)，從表面上看是增加了工作量，但實(shí)際上會(huì)大大提高工作效率。另外對(duì)于某些只需單次給藥的藥物，這類(lèi)試驗(yàn)一般已能滿足藥監(jiān)部門(mén)的要求。但這種外推往往也僅能得到一個(gè)大致的劑量范圍，對(duì)于產(chǎn)生具體效應(yīng)所需劑量的估計(jì)（如最大無(wú)作用劑量或最小有作用劑量）往往把握不大，可靠程度有限。更為合理和可靠的辦法還是先用少量動(dòng)物進(jìn)行短期的劑量摸索試驗(yàn)（或稱預(yù)試驗(yàn)，rangefindingtest）。

圖15-1重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)程序安排

①Traina法

先從大鼠的單次給藥毒性試驗(yàn)中找出最大無(wú)癥狀劑量，再分別以該劑量及其1/3和1/10量給三組大鼠（雌、雄各半）連續(xù)給藥2～3周，從中找出亞急性試驗(yàn)的最高劑量，在此劑量下動(dòng)物僅出現(xiàn)輕微的毒性反應(yīng)，如食耗量略減，體重增長(zhǎng)率略慢等。再以大鼠亞急性毒性試驗(yàn)的最高劑量為起點(diǎn)，給狗單次給藥，根據(jù)觀察結(jié)果適當(dāng)增減劑量（對(duì)數(shù)間隔），找出狗單次給藥的最大無(wú)癥狀劑量，再分別以此劑量及其1/3和1/10量給少數(shù)狗連續(xù)給藥2～3周，找出狗亞急性毒性試驗(yàn)的最高劑量。

②Homburger法

選擇一個(gè)劑量給雌、雄各5只大鼠，連續(xù)給藥2周，如果無(wú)動(dòng)物死亡再成倍增加劑量，直至首次出現(xiàn)死亡。