恒溫擴增-實時熒光法甲型/乙型流感病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序（依據(jù)WS/T227-2024臨床檢驗項目標(biāo)準(zhǔn)操作程序編寫要求）1承擔(dān)部門XX市中心醫(yī)院檢驗科PCR組。2檢驗?zāi)康挠糜谳o助診斷是否感染甲型流感感毒（FluA)、乙型流感病毒（FluB)。3原理和方法試劑盒中的Flu-檢測管，管內(nèi)設(shè)置多個疏水分隔層，將管內(nèi)的裂解液、清洗液和反應(yīng)液進行隔離。通過外部儀器的加熱控制，提取液在高溫下化學(xué)裂解檢測樣本并釋放出核酸。通過外部儀器磁導(dǎo)作用，使得檢測用的樣本核酸分別穿過不同液體層，最后核酸在管腿中被洗脫下來，發(fā)生擴增反應(yīng)，從而實現(xiàn)“一管式”的全自動核酸分析即在一個密閉檢測管內(nèi)完成裂解結(jié)合、清洗、洗脫和擴增反應(yīng)。Flu-檢測管預(yù)裝有核酸純化試劑、核酸洗脫試劑和交叉引物恒溫擴增試劑。上機前，用戶只需加入Flu-RNA提取液和待測樣本，在適用儀器控制下就能自動完成樣本中核酸的提純，提純后的核酸與擴增檢測試劑被適用儀器混勻加熱后進行擴增，同時熒光探針與靶標(biāo)發(fā)生特異性結(jié)合產(chǎn)生熒光信號。適用儀器采集熒光信號并自動判定檢驗結(jié)果。4性能特征4.1對國家參考品的檢測：按照流感病毒核酸檢測試劑國家參考品使用方法操作進行檢測：4.1.1檢測國家陽性參考品，陽性符合率100%。4.1.2檢測國家陰性參考品，陰性符合率100%。4.1.3檢測國家精密性參考品，結(jié)果均符合相應(yīng)要求。4.1.4檢測國家最低檢出限參考品，結(jié)果均符合相應(yīng)要求。4.2最低檢出限：本試劑盒對人咽拭子樣本中甲型流感病毒、乙型流感病毒的最低檢出限均為500copies/mL。4.3對企業(yè)參考品檢測的符合情況：4.3.1陰性參考品符合率：檢測企業(yè)陰性參考品，檢驗結(jié)果均為陰性，符合要求。4.3.2陽性參考品符合率：檢測企業(yè)陽性參考品，檢驗結(jié)果均為陽性，符合要求。4.3.3重復(fù)性參考品符合率：檢測企業(yè)重復(fù)性參考品，檢驗結(jié)果均為陽性，符合要求。4.4精密度：對中陽性、弱陽性以及陰性樣本進行20天、2人、3批次試劑檢測，批內(nèi)、批間重復(fù)性，日內(nèi)、日間重復(fù)性，室間重復(fù)性，操作者間重復(fù)性均良好，符合率100%。5標(biāo)本類型5.1咽拭子樣本。5.2樣本采集：用植絨拭子擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。5.3樣本儲存：咽拭子樣本應(yīng)盡快進行檢測。如果不能立即送檢，應(yīng)將樣本置于采樣液中，2℃～8℃冷藏不超過5天，室溫放置不超過24小時，-25℃～-15℃保存不超過6個月，長期保存請置于-60℃及以下，反復(fù)凍融不超過3次。6患者準(zhǔn)備采樣前2小時避免進食、喝水、吸煙、嚼口香糖等，以防影響結(jié)果。采樣前可漱口，但不要使用漱口水或藥物。7容器和添加劑類型選擇具有病毒滅活功能如含胍鹽（異硫氰酸胍或鹽酸胍等）或表面活性劑的采樣管。首選含胍鹽的采樣管。8儀器和試劑8.1儀器：杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司UC0108型核酸擴增檢測分析儀。8.2試劑：杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司UC0108型核酸擴增檢測分析儀配套試劑：甲型\乙型流感病毒核酸檢測試劑盒。8.2.1試劑盒組成及成分見下表：試劑盒組成及主要成分序號組分名稱規(guī)格主要成分1Flu-檢測管1測試/管特異性引物和探針、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶2Flu-RNA提取液1測試/管胍鹽、磁珠3Flu-陽性對照1管含靶標(biāo)片段4Flu-陰性對照1管不含靶標(biāo)片段注：不同批號試劑盒中各組分不能互換混用。Flu-陽性對照或Flu-陰性對照使用前需加入1.2mL的樣本保存液進行復(fù)溶使其完全溶解。8.2.2試劑盒儲存條件及有效期：2℃～8℃保存，有效期為12個月。8.2.3試劑盒運輸條件：本試劑盒正面朝上放入AB瓦楞紙箱(外包裝箱)中，在-25℃～37℃運輸7天不會影響產(chǎn)品性能。8.2.4試劑盒生產(chǎn)日期及失效日期：見標(biāo)簽。8.2.5試劑盒適用儀器型號：UC0102，UC0108。9環(huán)境和安全控制咽拭子標(biāo)本中存在潛在的生物危害因子，個人防護和廢棄物處理詳見《生物安全手冊》（編號：PJDEYY-SWAQ-AQSC06）。10操作步驟步驟操作圖示1試劑準(zhǔn)備：從試劑盒中取出對應(yīng)樣本數(shù)量的RNA提取液和檢測管，震蕩器充分混勻RNA提取液3秒～5秒后，將管內(nèi)液體直接倒入檢測管中。2加樣：輕輕混勻拭子樣本溶液后，吸取500μL加入檢測管，并旋緊管蓋。輕搖檢測管混勻樣本與磁珠提取液，上機檢測。3儀器準(zhǔn)備：打開儀器右側(cè)電源開關(guān)，等待儀器自檢結(jié)束后輸入賬號和密碼，進入檢測界面。4UC0108型核酸擴增檢測分析儀共有8個檢測模塊，可點擊顯示屏任一模塊位置，出現(xiàn)深藍(lán)背景即為選中模塊（如右圖選中模塊2）。5點擊“掃描檢測管二維碼”處，再將檢測管蓋子上的二維碼對準(zhǔn)掃描口，識別成功后，屏幕顯示“FAFB0”字樣。6再將檢測管蓋子上的二維碼對準(zhǔn)掃描口；或點擊屏幕上“掃描樣本條形碼”按鈕，輸入樣本編號。7按壓并打開模塊2蓋子，插入檢測管（放入前左右搖晃檢測管，使磁珠和樣本充分混勻），塑料環(huán)朝左放置，最后按壓合上模塊2蓋子。8點擊“開始檢測”按鈕，模塊2顯示倒計時間。程序結(jié)束，儀器自動顯示檢測結(jié)果。11檢驗結(jié)果及其解釋檢驗結(jié)果解釋FA陽性FB0陰性樣本中檢測到甲型流感病毒靶標(biāo)RNA；乙流的內(nèi)標(biāo)檢測滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，樣本中未檢測到乙型流感病毒靶標(biāo)RNA。FA陽性FB0陽性樣本中檢測到甲型流感病毒和乙型流感病毒靶標(biāo)RNA。FA陰性FB0陽性甲流的內(nèi)標(biāo)檢測滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，樣本中未檢測到甲型流感病毒的靶標(biāo)RNA；樣本中檢測到乙型流感病毒靶標(biāo)RNA。FA陰性FBO陰性樣本中未檢測到甲型和乙型流感病毒的靶標(biāo)RNA，且二者的內(nèi)標(biāo)檢測均滿足接受標(biāo)準(zhǔn)。FA陽性FB0無效樣本中檢測到甲型流感病毒靶標(biāo)RNA；乙流的內(nèi)標(biāo)檢測不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，不確定樣本中是否存在乙型流感病毒。FA陰性FB0無效甲流的內(nèi)標(biāo)檢測滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，樣本中未檢測到甲型流感病毒靶標(biāo)RNA；乙流的內(nèi)標(biāo)檢測不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，不確定樣本中是否存在乙型流感病毒。FA無效FB0陽性甲流的內(nèi)標(biāo)檢測不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，不確定樣本中是否存在甲型流感病毒；乙流的內(nèi)標(biāo)檢測滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，樣本中檢測到乙型流感病毒靶標(biāo)RNA。FA無效FB0陰性甲流的內(nèi)標(biāo)檢測不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，不確定樣本中是否存在甲型流感病毒；乙流的內(nèi)標(biāo)檢測滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，樣本中未檢測到乙型流感病毒靶標(biāo)RNA。FA無效FB0無效甲流的內(nèi)標(biāo)檢測不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，不確定樣本中是否存在甲型流感病毒；乙流的內(nèi)標(biāo)檢測不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，不確定樣本中是否存在乙型流感病毒。無結(jié)果檢測系統(tǒng)沒有收集到足夠的數(shù)據(jù)。12質(zhì)量控制12.1內(nèi)部質(zhì)控：本試劑盒的內(nèi)部質(zhì)控即內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)用以監(jiān)測采樣、提取、純化或擴增反應(yīng)、適用儀器是否異常。甲流、乙流檢驗結(jié)果為陽性時，對對應(yīng)內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果不做要求；甲流、乙流檢驗結(jié)果為陰性時，對應(yīng)內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果須為陽性(ICTt≤24)，否則檢驗結(jié)果為無效。12.2外部質(zhì)控：試劑盒中的Flu-陽性對照用于排除擴增試劑失效或適用儀器故障；Flu-陰性對照用于監(jiān)測試劑或環(huán)境是否被污染。Flu-陽性對照的檢驗結(jié)果應(yīng)為“FA陽性；FB0陽性”，F(xiàn)Lu-陰性對照的檢驗結(jié)果應(yīng)為“FA陰性；FB0陰性”。12.3第三方質(zhì)控：從冷藏冰箱中取出質(zhì)控品，室溫放置10min～15min后按常規(guī)樣本檢測。12.4質(zhì)控規(guī)則：陽性質(zhì)控品檢測結(jié)果不能為陰性，陰性質(zhì)控品檢測結(jié)果不能為陽性。12.5失控時應(yīng)采取的措施：失控時應(yīng)停止簽發(fā)檢驗報告，同時從檢查質(zhì)控品、試劑、儀器等原因入手，查找并記錄失控原因；失控糾正后再行患者標(biāo)本檢測。13干擾和交叉反應(yīng)分析13.1有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析13.1.1不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運及處理、樣本中病毒滴度過低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果13.1.2流感病毒待測靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?dǎo)致假陰性結(jié)果。13.1.3對于突發(fā)的新型流感病毒，其檢測的最適樣本類型及感染后的最佳采樣時間可能尚未確認(rèn)，因此，在同一患者分次、多部位采集樣本會降低假陰性結(jié)果的可能性。13.1.4未經(jīng)驗證的其他干擾或擴增抑制因子，可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。13.2有關(guān)假陽性結(jié)果的可能性分析13.2.1如果樣本在運輸、處理過程中發(fā)生交叉污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。13.2.2實驗環(huán)境有擴增產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。13.2.3實驗過程中使用的耗材、設(shè)備等受污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。13.2.4取樣本期間，接種減毒活疫苗的患者可能會導(dǎo)致檢測試劑檢測結(jié)果呈陽性。13.2.5不同病程不同階段樣本的陽性率可能不一致。13.2.6陽性和陰性預(yù)測值很大程度上取決于流行率。對某些病毒的檢驗性能可能隨檢測流行率和檢測人群變化。14參考區(qū)間陰性15臨床解釋15.1本試劑盒的檢驗結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀、體征、病史、其他實驗室檢查及治療效果等情況綜合考慮。15.2陽性結(jié)果：表明患者感染甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；陽性結(jié)果不能排除監(jiān)測指標(biāo)外細(xì)菌感染或其他混合感染病毒情況。15.3陰性結(jié)果：不能排除流感病毒感染，也不應(yīng)作為治療或制定其他患者管理決策的唯一依據(jù)。16檢驗結(jié)果報告方式序號項目結(jié)果參考區(qū)間靈敏度檢測方