TICS11.020TCCSC05團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CI569—2024先天畸形產(chǎn)前診斷分子標(biāo)志物鑒定與應(yīng)用技術(shù)規(guī)范Technicalspecificationsforidentificationandapplicationofmolecularmarkersforprenataldiagnosisofcongenitalmalformations2024-11-04發(fā)布 2024-11-04實施中國國際科技促進(jìn)會??發(fā)布T/CI569T/CI569—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1縮略語 2分子標(biāo)志物的鑒定 2鑒定工作的流程及準(zhǔn)備 2血液樣本采集及處理 4血液樣本的儲存及運輸 4分子標(biāo)志物檢測分析 5分子標(biāo)志物的性能確認(rèn) 5分子標(biāo)志物的應(yīng)用 6目標(biāo)疾病 6適宜檢測時間 6適用人群 6不適用人群 6臨床服務(wù)步驟 6附錄A（資料性） 知情同意書 8前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中國國際科技促進(jìn)會提出并歸口。本文件起草單位：中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院、山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院、北京大學(xué)、上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院。本文件主要起草人：袁正偉、黃國英、劉博洋、盛偉、李智文、馬巍、魏曉偉、賈杉杉、丁東雪、顧卉、羅文婷、劉丹、曹嵩穎、嚴(yán)衛(wèi)麗、呂軍、王達(dá)輝、靳蕾、苗茂華、袁偉。T/CI569T/CI569—2024PAGEPAGE1先天畸形產(chǎn)前診斷分子標(biāo)志物鑒定與應(yīng)用技術(shù)規(guī)范規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。先天畸形congenitalmalformation胚胎發(fā)育紊亂引起的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。注：最常見的先天畸形包括先天性心臟病、神經(jīng)管缺陷、唇腭裂等。產(chǎn)前診斷prenataldiagnosis宮內(nèi)診斷對胚胎或胎兒在出生前是否患有某種遺傳病或先天性畸形而進(jìn)行的診斷。注：產(chǎn)前診斷的目的在于早期發(fā)現(xiàn)可能影響胎兒健康的各種問題，以便提供相應(yīng)的醫(yī)療建議和干預(yù)措施，確保母嬰健康。分子標(biāo)志物biomarker生物過程的指示物，可以指示判斷生物過程、發(fā)病過程以及治療過程中藥理反應(yīng)的分子。樣本sample在某特定時間從受檢者或捐獻(xiàn)者采集到的組織、血液等標(biāo)本。捐贈者donor按照法定的醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)、程序和個人隱私法規(guī)確定后提供標(biāo)本的人或尸體。注：有的國家用“受試者”或“個體”來表示捐贈者，尤其是在涉及到人體標(biāo)本的時候。知情同意informedconsent醫(yī)生必須為患者提供足夠的相關(guān)信息，以便患者做出是否接受治療、參與試驗或醫(yī)學(xué)研究活動的自主決策。知情同意書informedconsentform生物安全柜biosafetycabinet具備氣流控制及高效空氣過濾裝置的操作柜。注：能有效降低實驗過程中產(chǎn)生的有害氣溶膠對操作者和環(huán)境的危害。標(biāo)簽label印在或貼在樣本容器或包裝上的手寫、印刷的文字，圖形，符號，以及一切說明物。先天性心臟病congenitalheartdisease注：（（分流（如法洛氏四聯(lián)癥、大血管錯位）類。神經(jīng)管缺陷neuraltubedefects由神經(jīng)管發(fā)生和分化紊亂導(dǎo)致的畸形。注：在胚胎發(fā)育的第15日～第17日，神經(jīng)系統(tǒng)開始發(fā)育，22日左右，神經(jīng)褶的兩側(cè)開始互相靠攏，形成1個管道，24日～第26膨出、腦脊髓膜膨出、脊柱裂（顯性脊柱裂、隱性脊柱裂）等。唇腭裂cleftlipandpalate表現(xiàn)為單獨唇裂、單獨腭裂或唇裂合并腭裂的口腔頜面部先天性畸形?？s略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）EDTA:乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay）GC-MS：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GasChromatography-MassSpectrometry）ICA：免疫層析分析（ImmunochromatographicAssay）LAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediatedIsothermalAmplification）LC-MS：液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LiquidChromatographyMassSpectrometry）MSD：多因子電化學(xué)發(fā)光分析（MesoScaleDiscovery）NMPA：國家藥品監(jiān)督管理局（NationalMedicalProductsAdministration）NMR：核磁共振波譜法（NuclearMagneticResonance）PBS：磷酸緩沖鹽溶液（PhosphateBufferSaline）PCR：聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction）RNA:核糖核酸（RibonucleicAcid）SAT：實時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)（SimultaneousAmplificationandTesting）SIMOA：單分子免疫陣列分析（SingleMoleculeArray）SOPs：標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(StandardOperatingProcedure)分子標(biāo)志物的鑒定鑒定工作的流程及準(zhǔn)備鑒定工作流程制定3（含3家中心獲取的標(biāo)本中進(jìn)行檢測。圖1為鑒定工作的基本流程圖。圖1 分子標(biāo)志物鑒定基本流程圖倫理審查及知情同意（應(yīng)根據(jù)知情同意書的內(nèi)容與捐贈者實驗室人員實驗環(huán)境實驗室儀器pHPCRPCRPCR實驗試劑及耗材NMPA樣本信息及實驗數(shù)據(jù)管理在開展樣本收集工作之前，實驗室及樣本庫需建立一套完善的信息收集、樣本運送及數(shù)據(jù)管理SOPs：樣本信息管理應(yīng)確保完整記錄捐贈者基本信息、診療記錄以及樣本操作記錄；SOPs（CSVXMLPDFJPEG等），保存位置及備份時間等，以確保原始數(shù)據(jù)的安全性和患者隱私得到妥善保護(hù)。血液樣本采集及處理血液樣本采集操作安全防護(hù)：采集的生物樣本都應(yīng)認(rèn)為是具有潛在感染性的。采樣過程中，相關(guān)工作人員應(yīng)做好采樣時的安全防護(hù)措施，保證捐贈者、工作人員安全和樣本不受污染。采樣流程：選擇采血管時宜充分考慮其抗凝劑對樣本及后續(xù)分析物（包括核酸、蛋白和代謝物5mL～10mL10RNADNA4℃冰箱暫存，暫存時間不6h，且應(yīng)在12h血液樣本處理4160010min。離心后用移液器DNA，也可在室溫條件下完成離心操作。4℃，16000min300μL/管～500μL/2游離核酸：應(yīng)盡量在48h總蛋白：按上述要求離心，根據(jù)實驗需求進(jìn)行分裝；100001h，4℃，1000004h，4100μLPBS3（透射電鏡、粒徑分析和外泌體表面標(biāo)志蛋白）鑒定分離得到的外泌體顆粒；代謝物：按上述要求離心，根據(jù)實驗需求進(jìn)行分裝。血細(xì)胞層的處理及應(yīng)用：將分離的白細(xì)胞層輕微吹打混勻后，根據(jù)后續(xù)實驗需求分裝至若干2DNARNADNADNA RNARNA：利用紅細(xì)胞裂解液裂解白細(xì)胞層中混雜的紅細(xì)胞；4℃10000g10min，分離白細(xì)胞團(tuán)；向白細(xì)胞團(tuán)中加入緩沖液清洗細(xì)胞團(tuán)，4℃條件下10000g離心10minRNA存液，吹打混合均勻；將含RNA的溶液按照研究需求進(jìn)行分裝，至少分為2管，以備份儲存。血液樣本的儲存及運輸血液樣本的儲存血液以儲存處理后的血液成分樣本為宜。儲存樣本應(yīng)分裝多管進(jìn)行備份，儲存于不同的儲存設(shè)備中，以避免污染、反復(fù)凍融及意外情況發(fā)生后損毀所有樣本。血液成分樣本如儲存期限不超過5年，可儲存在-80（5應(yīng)儲存在-132血液樣本的運輸運輸操作：樣本的運輸應(yīng)由樣本庫的工作人員或有資質(zhì)的生物物流公司來承擔(dān)。全血樣本應(yīng)2℃～8℃，以避免后期處理時的反復(fù)凍融。血液成分2020℃以下，保證樣本的生物學(xué)活性及細(xì)胞的完整性。分子標(biāo)志物檢測分析檢測前樣本質(zhì)檢DNA/蛋白的樣本，應(yīng)根據(jù)后續(xù)研究需求，提取DNA/蛋白并評估其完整性（降解程度）、純度和濃度。RNARNA（RIN）、濃度和純度。注1：RIN：RNA分子完整性指數(shù)。根據(jù)RNA毛細(xì)管電泳的結(jié)果計算得出的值，從10到1代表RNA從完整到不同程度的降解，反應(yīng)了RNA的完整/降解程度。注2：28S/18S：真核生物rRNA中28SrRNA與18SrRNA的比值，反映真核生物中提取的RNA28S、18S代表組成rRNA和s～13s稱為一個Svedberg單位，簡寫S。選擇檢測平臺ELISAMSDSIMOA、LuminexElla代謝物類生物標(biāo)志物的檢測平臺：對于脂類、多糖、氨基酸、脂肪酸和維生素等內(nèi)源性代謝NMR、LC-MSGC-MSPCRLAMPSATICA、PCR檢測操作質(zhì)控樣品設(shè)置：為了保證檢測體系的穩(wěn)定性和重復(fù)性應(yīng)設(shè)置質(zhì)控樣品。實驗室可根據(jù)檢測項設(shè)置實驗組與對照組：包括樣本分組、陰性對照、陽性對照和校準(zhǔn)品等。（SOPs）重復(fù)實驗：進(jìn)行必要的重復(fù)實驗，以驗證結(jié)果的重復(fù)性。檢測結(jié)果分析2名及以上的專業(yè)人員進(jìn)行雙盲統(tǒng)計分析及可視化，相關(guān)結(jié)果應(yīng)結(jié)合生物學(xué)知識，進(jìn)行解釋，并通過實驗驗證。分子標(biāo)志物的性能確認(rèn)精密度：指同一樣本在多次檢測中結(jié)果的一致程度，包括重復(fù)性和再現(xiàn)性兩個方面。其中重復(fù)性指在同一條件下（相同環(huán)境、相同操作人員、相同檢測流程、相同儀器）多次測量同一分子標(biāo)志物，測定結(jié)果的一致程度；再現(xiàn)性指由不同操作人員、不同儀器（相同型號）和不同批試劑進(jìn)行同一分子標(biāo)志物測量結(jié)果的一致性程度。準(zhǔn)確性：所檢測的分子標(biāo)志物預(yù)測的胎兒畸形情況與實際情況的一致性程度。對準(zhǔn)確性的評價可通過檢測隊列樣本進(jìn)行驗證，包括孕有先天畸形胎兒的孕婦血液樣本及正常胎兒孕婦血液樣本，評價范圍應(yīng)包括具有明確臨床意義的分子標(biāo)志物（AFP）。特異性：確認(rèn)標(biāo)志物與特定疾病狀態(tài)相關(guān)，而不是與其他疾病或正常狀態(tài)混淆。靈敏度：評估標(biāo)志物檢測疾病狀態(tài)的能力，即所有病例中被正確識別的比例。陽性預(yù)測值（PPV）：在標(biāo)志物陽性的情況下，實際患有疾病的概率。陰性預(yù)測值（NPV）：在標(biāo)志物陰性的情況下，實際未患有疾病的概率?？蓤蟾娣秶簷z測方法能夠準(zhǔn)確、可靠地報告這些分子標(biāo)志物濃度的范圍等。分子標(biāo)志物的應(yīng)用目標(biāo)疾病適宜檢測時間孕婦外周血先天畸形產(chǎn)前診斷分子標(biāo)志物篩查應(yīng)在產(chǎn)前超聲檢查明確胎兒畸形前進(jìn)行，適宜孕周為8+0周～20+0周。適用人群早、中孕期產(chǎn)前篩查高風(fēng)險；預(yù)產(chǎn)期年齡≥35體重指數(shù)>40kg/；經(jīng)過體外受精—胚胎移植方法受孕；雙胎及多胎妊娠；有先天畸形相關(guān)疾病家族史；有介入性產(chǎn)前診療禁忌證者（如先兆流產(chǎn)、發(fā)燒、出血傾向、慢性病原體感染活動期、孕婦Rh）。不適用人群有下列情形孕婦進(jìn)行檢測時，可能嚴(yán)重影響結(jié)果正確性。包含：孕周<801有基因遺傳病家族史或提示胎兒罹患基因病高風(fēng)險；孕期合并惡性腫瘤；醫(yī)師認(rèn)為有顯著影響結(jié)果正確性的其他情形。臨床服務(wù)步驟檢測前咨詢及知情同意告知本技術(shù)目標(biāo)疾病；告知本技術(shù)檢出率、假陽性和假陰性率，強(qiáng)調(diào)該檢測結(jié)果不是產(chǎn)前診療結(jié)果，高風(fēng)險結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步檢查以確診，以及檢測費用與步驟等；告知本技術(shù)有因檢測失敗重新采血可能；告知影響該檢測正確性相關(guān)原因；醫(yī)師對病例個案認(rèn)為需要說明的相關(guān)問題。檢測信息采集待檢血液采集血液樣本檢測5.2～5.4臨床報告出具發(fā)放自采血至發(fā)放臨床報告時間不超出1510送檢單位和送檢醫(yī)師姓名；孕婦基礎(chǔ)信息，包含姓名、年齡、末次月經(jīng)時間、孕周等；標(biāo)本信息，包含標(biāo)本編號、標(biāo)本狀態(tài)、采血日期等；檢測項目和檢測方法；目標(biāo)疾病檢測值、參考范圍、低風(fēng)險或高風(fēng)險結(jié)果；結(jié)果描述和提議；檢測單位、檢測時間、檢測人員及審核人員署名；臨床報告審核發(fā)放時間、審核醫(yī)師署名。檢測后咨詢及處理對于目標(biāo)疾病以外其他異常高風(fēng)險結(jié)果，產(chǎn)前診療機(jī)構(gòu)應(yīng)通知孕婦本人或其家屬進(jìn)行深入咨詢和診療。妊娠結(jié)局隨訪標(biāo)本和資料信息保留附 錄 A（資料性）知情同意書捐贈者知情同意書包含兩部分，其中捐贈者須知模板見圖A.1，知情同意簽名模板見圖A.2。第一部分捐贈者須知項目名稱：×××××××××××× 項目收集單位：×××××××××××××項目簡介：×××××××××××××××××××××××××××我們在征得您同意的情況下，收集您的血液××mL。您享有的權(quán)益：自由、自愿選擇留存您的生物樣本給××××××樣本庫，您可以在任何時候無您需要做的事：告知樣本采集人員有關(guān)自身或家族史、當(dāng)前身體狀況、是否正在使用某些藥物、是否曾經(jīng)參與其他研究、目前是否正在參與其他研究等信息。收益：您的樣本將被用于保存及科學(xué)研究，我們希望基于您的樣本所得到的研究結(jié)果未來將對疾病的診治有所幫助。您將不會分享樣本的研究成果和成果產(chǎn)生的相關(guān)收益（另有協(xié)議約定的情況除外）。風(fēng)險與不適：抽取血液樣本，我們按照醫(yī)院常規(guī)采血流程進(jìn)行，若出