一、引言1.1研究背景與意義水稻作為全球最重要的糧食作物之一，是超過半數(shù)世界人口的主食，在保障全球糧食安全中占據(jù)著舉足輕重的地位。在中國，水稻種植歷史悠久，分布廣泛，其播種面積和產(chǎn)量均在糧食作物中名列前茅，對滿足國內(nèi)龐大人口的糧食需求、穩(wěn)定糧食市場供應(yīng)起著關(guān)鍵作用。據(jù)統(tǒng)計，我國水稻年產(chǎn)量穩(wěn)定在數(shù)億噸，養(yǎng)活了大量人口，是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要支柱。褐飛虱（NilaparvatalugensSt?l）作為水稻生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的遷飛性害蟲之一，對水稻的危害極其嚴(yán)重。褐飛虱具有繁殖速度快、遷飛能力強、適應(yīng)范圍廣等特點，其整個生命周期包括卵、若蟲和成蟲三種蟲態(tài)，在適宜的氣候條件下，短時間內(nèi)就能大量繁殖，對水稻造成嚴(yán)重威脅。褐飛虱主要通過刺吸水稻植株的汁液獲取營養(yǎng)，導(dǎo)致水稻生長發(fā)育受阻，葉片發(fā)黃、枯萎，嚴(yán)重時可使水稻整株倒伏，產(chǎn)量大幅下降，甚至絕收。據(jù)相關(guān)研究表明，在褐飛虱大爆發(fā)年份，一些地區(qū)的水稻減產(chǎn)可達(dá)30%-50%，嚴(yán)重影響了糧食產(chǎn)量和農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。此外，褐飛虱還能傳播水稻病毒病，如水稻齒葉矮縮病、水稻草叢矮縮病等，進(jìn)一步加重了對水稻生產(chǎn)的危害，導(dǎo)致水稻品質(zhì)下降，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。長期以來，化學(xué)防治一直是控制褐飛虱危害的主要手段。化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用雖然在一定程度上有效地控制了褐飛虱的種群數(shù)量，保障了水稻的產(chǎn)量，但也帶來了一系列嚴(yán)重的問題。一方面，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致褐飛虱的抗藥性不斷增強。隨著農(nóng)藥使用頻率和劑量的增加，褐飛虱逐漸適應(yīng)了農(nóng)藥的環(huán)境，通過基因突變等方式產(chǎn)生抗藥性，使得原本有效的農(nóng)藥逐漸失去防治效果。這不僅增加了防治成本，還迫使農(nóng)民不斷加大農(nóng)藥使用量，形成惡性循環(huán)。另一方面，化學(xué)農(nóng)藥的使用對環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。農(nóng)藥殘留會在土壤、水體和空氣中積累，破壞生態(tài)平衡，影響非靶標(biāo)生物的生存和繁衍，對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生物多樣性構(gòu)成威脅。此外，農(nóng)藥殘留還可能通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康，引發(fā)各種疾病。在這種背景下，深入研究水稻響應(yīng)褐飛虱的分子機(jī)理，尋找綠色、可持續(xù)的防治方法具有重要的現(xiàn)實意義。微小RNA（miRNA）作為一類重要的非編碼RNA，在植物生長發(fā)育、逆境響應(yīng)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。近年來，越來越多的研究表明，miRNA參與了植物對病蟲害的防御反應(yīng)，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響植物的抗性。研究miRNA調(diào)控水稻響應(yīng)褐飛虱的分子機(jī)理，不僅可以揭示水稻與褐飛虱之間的互作機(jī)制，豐富植物與昆蟲互作的理論知識，還能為水稻抗褐飛虱品種的選育提供新的理論依據(jù)和分子靶點。通過調(diào)控miRNA的表達(dá)或利用其靶基因，可以培育出具有更高抗性的水稻品種，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低對環(huán)境的污染，實現(xiàn)水稻的綠色安全生產(chǎn)，保障糧食安全和生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入剖析miRNA在水稻響應(yīng)褐飛虱過程中的調(diào)控作用，從分子層面揭示水稻與褐飛虱互作的內(nèi)在機(jī)制，為水稻抗褐飛虱育種及綠色防控策略的制定提供堅實的理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下：水稻響應(yīng)褐飛虱取食的miRNA鑒定與表達(dá)分析：通過高通量測序技術(shù)，全面鑒定在褐飛虱取食脅迫下水稻中差異表達(dá)的miRNA。選取典型的感蟲和抗蟲水稻品種，分別在褐飛虱取食后的不同時間點（如12小時、24小時、48小時等）采集樣本，構(gòu)建小RNA文庫并進(jìn)行測序。利用生物信息學(xué)分析方法，篩選出在感蟲和抗蟲品種中表達(dá)模式存在顯著差異的miRNA。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對測序結(jié)果進(jìn)行驗證，確保數(shù)據(jù)的可靠性。同時，分析這些miRNA在不同組織（如葉片、莖稈、葉鞘等）中的表達(dá)特異性，明確其在水稻響應(yīng)褐飛虱過程中的時空表達(dá)規(guī)律。miRNA靶基因的預(yù)測與驗證：借助生物信息學(xué)工具，如psRNATarget等，對篩選出的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測。依據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，對預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行功能注釋和分類，初步推斷miRNA可能參與的生物學(xué)過程。采用5'-RACE（快速擴(kuò)增cDNA末端）技術(shù)和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸Π谢蜻M(jìn)行驗證。通過5'-RACE技術(shù)確定miRNA與靶基因mRNA的精確切割位點，驗證二者的靶向關(guān)系；構(gòu)建包含miRNA結(jié)合位點的靶基因3'-UTR（非翻譯區(qū)）報告載體和miRNA表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至水稻原生質(zhì)體或其他合適的細(xì)胞系中，檢測雙熒光素酶活性，從功能層面驗證miRNA對靶基因的調(diào)控作用。miRNA調(diào)控水稻響應(yīng)褐飛虱的分子機(jī)制解析：綜合分析miRNA及其靶基因的表達(dá)變化，結(jié)合水稻在褐飛虱取食后的生理生化指標(biāo)變化（如防御酶活性、激素含量等），深入探討miRNA在水稻防御褐飛虱過程中的調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA可能通過調(diào)控植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)，影響茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）等激素的合成和信號傳遞，從而激活或抑制水稻的防御反應(yīng)。利用基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）對關(guān)鍵miRNA或靶基因進(jìn)行敲除或過表達(dá)，觀察水稻對褐飛虱抗性的變化，進(jìn)一步驗證miRNA調(diào)控水稻抗褐飛虱的分子機(jī)制。通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得miRNA敲除或過表達(dá)的水稻轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行褐飛虱接種試驗，測定其抗蟲性指標(biāo)（如褐飛虱的存活率、繁殖率、取食偏好等），明確關(guān)鍵miRNA在水稻抗褐飛虱中的功能。miRNA在水稻抗褐飛虱育種中的應(yīng)用潛力評估：對具有潛在抗褐飛虱功能的miRNA進(jìn)行深入研究，評估其在水稻抗褐飛虱育種中的應(yīng)用價值。分析不同水稻品種中這些miRNA及其靶基因的自然變異情況，篩選出與抗褐飛虱性狀緊密相關(guān)的遺傳標(biāo)記。通過分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）技術(shù)，將攜帶有利miRNA或靶基因變異的材料引入優(yōu)良水稻品種中，培育具有高抗褐飛虱能力的水稻新品系。同時，研究miRNA與其他抗褐飛虱基因或QTL（數(shù)量性狀基因座）的互作關(guān)系，為構(gòu)建多基因聚合的抗褐飛虱水稻品種提供理論支持。1.3研究方法與技術(shù)路線樣本采集與處理：挑選具有代表性的感蟲水稻品種（如TN1）和抗蟲水稻品種（如IR36），在溫室條件下進(jìn)行種植，控制溫度在28±2℃，相對濕度為70%-80%，光照周期為16h光照/8h黑暗。待水稻生長至分蘗期，接入羽化后1-2天的褐飛虱成蟲，按照每株5-10頭的密度進(jìn)行接種。分別在褐飛虱取食0h（對照）、12h、24h、48h后，采集水稻葉片、莖稈和葉鞘等組織樣本。將采集的樣本迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的RNA提取和相關(guān)分析。RNA提取與測序：采用TRIzol試劑法從水稻樣本中提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計檢測RNA的完整性和純度，確保RNA的質(zhì)量符合要求。利用IlluminaHiSeq測序平臺對小RNA進(jìn)行高通量測序，構(gòu)建小RNA文庫。在文庫構(gòu)建過程中，對小RNA進(jìn)行分離、連接接頭、逆轉(zhuǎn)錄等操作，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過去除接頭序列、低質(zhì)量讀段和長度篩選等預(yù)處理，得到高質(zhì)量的cleanreads，用于后續(xù)的miRNA鑒定和表達(dá)分析。miRNA鑒定與表達(dá)分析：將cleanreads與水稻參考基因組進(jìn)行比對，利用miRBase等數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)分析方法，鑒定已知miRNA和預(yù)測新的miRNA。根據(jù)測序數(shù)據(jù)中miRNA的表達(dá)量，計算每百萬映射reads中來自某一miRNA的reads數(shù)（TPM），以此來表示miRNA的表達(dá)水平。運用DESeq2等軟件對不同樣本間的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選出在褐飛虱取食脅迫下差異表達(dá)顯著的miRNA（|log2FC|≥1且FDR<0.05）。靶基因預(yù)測與驗證：運用psRNATarget、TargetFinder等生物信息學(xué)工具，對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測。預(yù)測過程中，根據(jù)miRNA與靶基因mRNA互補配對的原則，結(jié)合相關(guān)算法和參數(shù)，篩選出可能的靶基因。對預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行功能注釋，利用GO（GeneOntology）數(shù)據(jù)庫和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫，分析靶基因參與的生物學(xué)過程、分子功能和信號通路。采用5'-RACE技術(shù)驗證miRNA與靶基因的靶向關(guān)系，根據(jù)預(yù)測的靶基因序列設(shè)計特異性引物，對水稻RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，確定miRNA在靶基因mRNA上的切割位點。構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體，將含有miRNA結(jié)合位點的靶基因3'-UTR片段克隆到熒光素酶報告基因載體的下游，與miRNA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至水稻原生質(zhì)體或其他合適的細(xì)胞系中，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，驗證miRNA對靶基因的調(diào)控作用。分子機(jī)制解析：通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，進(jìn)一步檢測miRNA及其靶基因在褐飛虱取食不同時間點的表達(dá)變化，驗證測序和生物信息學(xué)分析的結(jié)果。同時，測定水稻在褐飛虱取食后的生理生化指標(biāo)，如防御酶（如過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、超氧化物歧化酶SOD等）活性、植物激素（如茉莉酸JA、水楊酸SA、乙烯ETH等）含量的變化。分析miRNA表達(dá)變化與生理生化指標(biāo)變化之間的相關(guān)性，探討miRNA在水稻防御褐飛虱過程中的調(diào)控機(jī)制。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對關(guān)鍵miRNA或靶基因進(jìn)行敲除，設(shè)計針對關(guān)鍵miRNA或靶基因的sgRNA（single-guideRNA），構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將載體導(dǎo)入水稻愈傷組織，經(jīng)過篩選和分化培養(yǎng)，獲得miRNA或靶基因敲除的水稻轉(zhuǎn)基因植株。對敲除植株進(jìn)行褐飛虱接種試驗，觀察其抗蟲性變化，與野生型水稻進(jìn)行對比，分析關(guān)鍵miRNA或靶基因在水稻抗褐飛虱中的功能。構(gòu)建miRNA過表達(dá)載體，將miRNA的前體序列克隆到植物表達(dá)載體中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得miRNA過表達(dá)的水稻轉(zhuǎn)基因植株。對過表達(dá)植株進(jìn)行褐飛虱接種試驗，測定其抗蟲性指標(biāo)，進(jìn)一步驗證miRNA在水稻抗褐飛虱中的作用。應(yīng)用潛力評估：收集不同水稻品種的種子，在田間種植，待水稻生長至合適時期，進(jìn)行褐飛虱接種試驗，調(diào)查不同品種對褐飛虱的抗性表現(xiàn)。提取不同水稻品種的基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)，分析具有潛在抗褐飛虱功能的miRNA及其靶基因的自然變異情況。通過關(guān)聯(lián)分析等方法，篩選出與抗褐飛虱性狀緊密相關(guān)的遺傳標(biāo)記。利用分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）技術(shù)，以與抗褐飛虱相關(guān)的miRNA或靶基因的遺傳標(biāo)記為篩選指標(biāo)，對水稻育種材料進(jìn)行篩選。將攜帶有利miRNA或靶基因變異的材料與優(yōu)良水稻品種進(jìn)行雜交和回交，通過多代選擇，培育具有高抗褐飛虱能力的水稻新品系。在育種過程中，結(jié)合田間試驗和分子檢測，對選育的品系進(jìn)行抗蟲性和農(nóng)藝性狀的綜合評價。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從樣本采集、RNA提取、測序分析、靶基因驗證、分子機(jī)制研究到應(yīng)用潛力評估的整個流程，各步驟之間用箭頭連接，標(biāo)注關(guān)鍵技術(shù)和方法]綜上所述，本研究通過多種研究方法和技術(shù)路線，從分子層面深入探究miRNA調(diào)控水稻響應(yīng)褐飛虱的機(jī)制，為水稻抗褐飛虱育種和綠色防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。二、褐飛虱與水稻的相互作用概述2.1褐飛虱的生物學(xué)特性與危害褐飛虱（NilaparvatalugensSt?l）隸屬半翅目飛虱科，是亞洲地區(qū)水稻生產(chǎn)中極具威脅性的害蟲，在2020年9月15日被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入一類農(nóng)作物病蟲害名錄。其形態(tài)特征鮮明，成蟲具有長翅型和短翅型兩種形態(tài)。長翅型體長通常在3.6-4.8毫米之間，短翅型體長則為2.5-4.0毫米，整體呈現(xiàn)黃褐、黑褐色，體表散發(fā)著油狀光澤。其頭頂近似方形，額部接近長方形，中部稍寬，觸角微微伸出額唇基縫，后足基跗節(jié)外側(cè)生有2-4根小刺。長翅型的前翅為黃褐色，質(zhì)地透明，翅斑呈黑褐色；短翅型的前翅僅能伸達(dá)腹部第5-6節(jié)，后翅多退化。雄蟲的陽基側(cè)突形狀如同蟹鉗，頂部呈尖角狀朝內(nèi)前方突出；雌蟲的產(chǎn)卵器基部兩側(cè)，第1載瓣片的內(nèi)緣基部突起呈半圓形。卵呈香蕉型，長約1毫米，寬0.22毫米，產(chǎn)在葉鞘和葉片組織內(nèi)，排列成“卵條”狀。卵帽高度大于寬度，頂端呈圓弧狀，稍微露出產(chǎn)卵痕，露出部分近似短橢圓形，粗看類似小方格，清晰可辨。初產(chǎn)時卵為乳白色，隨后逐漸變?yōu)榈S至銹褐色，并出現(xiàn)紅色眼點。若蟲共分為5齡，各齡的特征存在差異。1齡若蟲體長1.1毫米，體色黃白，腹部背面有一倒凸形淺色斑紋，后胸明顯比前、中胸長，中、后胸后緣較為平直，無翅芽；2齡若蟲體長1.5毫米，初期體色與1齡相似，倒凸形斑內(nèi)逐漸出現(xiàn)褐色，后期體呈黃褐至暗褐色，倒凸形斑逐漸模糊，翅芽不明顯，后胸稍長，中胸后緣略向前凹；3齡若蟲體長2.0毫米，體色為黃褐色至暗褐色，腹部第3、4節(jié)有一對較大的淺色斑紋，第7-9節(jié)的淺色斑呈山字形，翅芽已明顯可見，中、后胸后緣向前凹成角狀，前翅芽尖端不到后胸后緣；4齡若蟲體長2.4毫米，體色斑紋與3齡相似，斑紋清晰，前翅芽尖端伸達(dá)后胸后緣；5齡若蟲體長3.2毫米，體色斑紋同3、4齡，前翅芽尖端伸達(dá)腹部第3-4節(jié)，前后翅芽尖端接近，或前翅芽稍超過后翅芽。褐飛虱的生活史復(fù)雜且具有獨特的習(xí)性。它是一種遠(yuǎn)距離遷飛性害蟲，在我國，其每年發(fā)生的代數(shù)會隨著緯度和年總積溫、遷入時期以及水稻栽培期的不同而變化。例如，海南地區(qū)年生12-13代，世代重疊且常年繁殖，無越冬現(xiàn)象；廣東、廣西、福建南部年生8-9代，3-5月遷入；江蘇、安徽南部4-5代，6-7月上中旬遷入。我國大部分稻區(qū)的主要蟲源會隨著每年春、夏的暖濕氣流由南向北遷入和推進(jìn)，每年大約有5次大規(guī)模的遷飛行動，秋季則從北向南回遷。成蟲對嫩綠水稻具有明顯的趨性，雄蟲可進(jìn)行多次交配，在24-27℃的環(huán)境下，羽化后2-3天便開始交配，每只雌蟲平均產(chǎn)卵200-700粒。水稻生長期間，各世代的平均壽命為10-18天，田間增殖倍數(shù)每代可達(dá)10-40倍。成、若蟲偏好陰濕環(huán)境，常棲息在距水面10厘米以內(nèi)的稻株上。當(dāng)田間蟲口密度達(dá)到每叢高于0.4頭時，便會出現(xiàn)不均勻分布的情況，后期田間甚至?xí)霈F(xiàn)塌圈枯死現(xiàn)象。水稻生長后期，大量長翅型成蟲會產(chǎn)生并遷出，1-3齡是翅型分化的關(guān)鍵時期。褐飛虱對水稻的危害十分嚴(yán)重，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：其一，直接吸食危害。成、若蟲群集于稻叢底部，通過刺吸莖葉組織汁液來獲取營養(yǎng)，這會導(dǎo)致水稻植株的含水量迅速下降。同時，其唾液腺分泌的一種有毒物質(zhì)會破壞水稻植株組織，在受損的莖上形成許多褐色斑點。當(dāng)水稻受害嚴(yán)重時，稻株基部會變黑，整株癱瘓倒伏，這種現(xiàn)象俗稱“冒穿”“虱燒”“透天”，最終導(dǎo)致水稻嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。其二，產(chǎn)卵危害。雌蟲在產(chǎn)卵時，會用鋒利的產(chǎn)卵管穿透葉鞘和莖組織，在其中產(chǎn)卵，這一過程會形成大量傷口。這些傷口不僅促使水分由刺傷點向外散失，加速稻株倒伏，還為水稻小球菌核病等病菌提供了直接入侵稻株的途徑。其三，傳播或誘發(fā)水稻病害。褐飛虱能夠傳播水稻齒葉矮縮病、水稻草叢狀矮縮病等病毒病，極大地影響水稻的正常生長發(fā)育。此外，其取食時排泄的蜜露富含各種糖類、氨基酸類物質(zhì)，覆蓋在稻株上后，極易招致煤煙病菌的滋生，進(jìn)而影響水稻的光合作用，阻礙水稻的正常生長和物質(zhì)積累。2.2水稻對褐飛虱的防御反應(yīng)在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，水稻針對褐飛虱的危害，演化出了一系列復(fù)雜且多樣的防御反應(yīng)，這些反應(yīng)涵蓋了物理、生理生化以及分子等多個層面，共同構(gòu)成了水稻抵御褐飛虱侵害的防御體系。從物理屏障方面來看，水稻的葉片和莖稈表面存在著多種物理結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在一定程度上能夠阻礙褐飛虱的取食和產(chǎn)卵。例如，水稻葉片表面的蠟質(zhì)層具有一定的疏水性和硬度，能夠減少褐飛虱口器與葉片組織的直接接觸，增加其取食難度。同時，葉片表面的茸毛密度和長度也與水稻的抗蟲性密切相關(guān)。研究表明，茸毛較多且較長的水稻品種，能夠?qū)诛w虱的爬行和取食產(chǎn)生明顯的阻礙作用，使褐飛虱在葉片上的活動受到限制，從而降低其取食效率。此外，水稻莖稈的機(jī)械強度也是影響褐飛虱侵害的重要因素。莖稈粗壯、細(xì)胞壁加厚的水稻品種，能夠更好地抵御褐飛虱的穿刺和取食，減少莖稈受損的風(fēng)險，進(jìn)而提高水稻的抗蟲能力。在生理生化變化方面，水稻在遭受褐飛虱取食后，會迅速啟動一系列生理生化反應(yīng)，以增強自身的防御能力。當(dāng)褐飛虱取食水稻時，水稻細(xì)胞會感知到外界的傷害信號，進(jìn)而激活相關(guān)的防御基因表達(dá)。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與了多種生理生化過程，如防御酶的合成、植物激素的代謝以及次生代謝產(chǎn)物的積累等。其中，防御酶在水稻的防御反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）等防御酶的活性會在褐飛虱取食后顯著升高。POD能夠催化過氧化氫分解，產(chǎn)生具有氧化作用的自由基，這些自由基可以氧化褐飛虱口器中的蛋白質(zhì)和酶，使其失去活性，從而抑制褐飛虱的取食。PPO則可以將酚類物質(zhì)氧化為醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)具有較強的毒性，能夠?qū)诛w虱的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理功能造成損害。SOD能夠清除細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子自由基，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，防止細(xì)胞受到氧化損傷，保證水稻自身的正常生理功能，同時也間接參與了對褐飛虱的防御反應(yīng)。植物激素在水稻對褐飛虱的防御反應(yīng)中也起著重要的調(diào)控作用。茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）是植物體內(nèi)兩種重要的防御信號分子。當(dāng)水稻受到褐飛虱取食時，體內(nèi)的JA和SA信號通路會被激活。JA信號通路主要參與水稻對咀嚼式口器害蟲和病原菌的防御反應(yīng)，而SA信號通路則在水稻對刺吸式口器害蟲和病毒的防御中發(fā)揮重要作用。在褐飛虱取食后，水稻體內(nèi)的JA含量會迅速升高，激活一系列與JA相關(guān)的防御基因表達(dá)，如編碼蛋白酶抑制劑、植保素合成酶等基因。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠抑制褐飛虱體內(nèi)蛋白酶的活性，干擾其消化過程，減少褐飛虱對水稻營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，從而降低褐飛虱的生長和繁殖能力。同時，JA還可以誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，吸引褐飛虱的天敵，如寄生蜂、捕食性昆蟲等，對褐飛虱進(jìn)行生物防治。SA信號通路的激活則會誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白（PR蛋白），這些蛋白具有抗菌、抗病毒和抗蟲等多種功能，能夠增強水稻對褐飛虱的抗性。此外，SA還可以通過調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，增強水稻的防御能力。從分子水平防御角度出發(fā)，水稻在褐飛虱取食脅迫下，會發(fā)生一系列基因表達(dá)的變化，涉及眾多與防御相關(guān)的基因家族。轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子，在水稻響應(yīng)褐飛虱的過程中發(fā)揮著重要作用。WRKY、MYB、NAC等轉(zhuǎn)錄因子家族的成員在褐飛虱取食后表達(dá)量會發(fā)生顯著變化。這些轉(zhuǎn)錄因子可以通過與下游防御基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，激活或抑制防御基因的表達(dá)，從而調(diào)控水稻的防御反應(yīng)。例如，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以與防御基因啟動子中的W-box元件結(jié)合，促進(jìn)防御基因的表達(dá)，增強水稻對褐飛虱的抗性。此外，一些受體激酶基因也參與了水稻對褐飛虱的識別和防御信號傳導(dǎo)過程。這些受體激酶能夠感知褐飛虱取食時分泌的唾液蛋白或其他信號分子，激活下游的防御信號通路，啟動水稻的防御反應(yīng)。研究表明，水稻中的一些類受體激酶（RLKs）可以識別褐飛虱唾液中的特定蛋白，將信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活一系列防御基因的表達(dá)，從而增強水稻的抗蟲性。2.3現(xiàn)有水稻抗褐飛虱研究進(jìn)展長期以來，水稻抗褐飛虱的研究工作一直是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重點，旨在培育出具有高抗性的水稻品種，減少褐飛虱對水稻生產(chǎn)的危害。在傳統(tǒng)抗蟲育種方面，科研人員通過廣泛收集水稻種質(zhì)資源，運用雜交、回交等常規(guī)育種手段，將抗褐飛虱的優(yōu)良性狀整合到栽培品種中。例如，國際水稻研究所（IRRI）從20世紀(jì)60年代開始，通過對大量水稻品種進(jìn)行篩選和鑒定，成功選育出一系列具有抗褐飛虱特性的品種，如IR26、IR36等。這些品種在東南亞等褐飛虱頻發(fā)地區(qū)的推廣種植，有效地降低了褐飛虱的危害程度，提高了水稻產(chǎn)量。在中國，育種工作者也積極開展抗褐飛虱水稻品種的選育，通過對地方品種和野生稻資源的挖掘和利用，培育出了許多適合國內(nèi)不同生態(tài)區(qū)域種植的抗蟲品種。然而，傳統(tǒng)抗蟲育種方法存在一定的局限性。一方面，育種周期較長，通常需要經(jīng)過多代的雜交和選育，才能獲得穩(wěn)定遺傳的抗蟲品種，這需要耗費大量的時間和人力成本。另一方面，傳統(tǒng)育種方法難以準(zhǔn)確地對目標(biāo)基因進(jìn)行定位和選擇，容易受到其他基因的干擾，導(dǎo)致育種效率低下。此外，隨著褐飛虱種群的不斷進(jìn)化和變異，一些原本具有抗性的水稻品種逐漸失去抗性，這也給傳統(tǒng)抗蟲育種帶來了新的挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，水稻抗褐飛虱的研究逐漸深入到分子層面。在抗性基因挖掘方面，科研人員利用分子標(biāo)記技術(shù)、圖位克隆技術(shù)等，成功克隆了多個水稻抗褐飛虱基因，如Bph14、Bph15、Bph30等。這些基因的克隆，為深入了解水稻抗褐飛虱的分子機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)。例如，Bph14基因編碼一個富含亮氨酸重復(fù)序列的類受體激酶，能夠識別褐飛虱唾液中的特定蛋白，激活水稻的防御反應(yīng)；Bph15基因則編碼一個未知功能的蛋白，通過與其他蛋白相互作用，調(diào)控水稻的抗蟲信號傳導(dǎo)途徑。在信號通路解析方面，研究表明，水稻對褐飛虱的防御反應(yīng)涉及多個信號通路的協(xié)同作用，其中茉莉酸（JA）信號通路和水楊酸（SA）信號通路在水稻抗褐飛虱過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)水稻受到褐飛虱取食時，JA和SA信號通路被激活，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，合成一系列防御物質(zhì)，如蛋白酶抑制劑、植保素等，從而增強水稻的抗蟲性。此外，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、鈣離子信號通路等也參與了水稻對褐飛虱的防御反應(yīng)，這些信號通路之間相互交織，形成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。盡管在水稻抗褐飛虱的研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多問題亟待解決。例如，對于一些抗褐飛虱基因的功能和作用機(jī)制還不完全清楚，需要進(jìn)一步深入研究；不同抗褐飛虱基因之間的互作關(guān)系以及它們在水稻抗蟲網(wǎng)絡(luò)中的地位和作用也有待進(jìn)一步闡明；此外，如何將抗褐飛虱基因有效地應(yīng)用于水稻育種實踐，培育出具有持久抗性的水稻品種，也是當(dāng)前面臨的重要挑戰(zhàn)。因此，深入研究水稻響應(yīng)褐飛虱的分子機(jī)理，對于揭示水稻與褐飛虱之間的互作機(jī)制，培育抗蟲水稻品種，保障水稻生產(chǎn)安全具有重要的意義。三、miRNA的生物學(xué)基礎(chǔ)與功能3.1miRNA的發(fā)現(xiàn)與定義miRNA的發(fā)現(xiàn)歷程充滿了探索與突破，為生命科學(xué)領(lǐng)域開啟了一扇全新的大門。1993年，美國科學(xué)家VictorAmbros和GaryRuvkun在對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）的發(fā)育調(diào)控研究中取得了開創(chuàng)性成果。他們在研究線蟲發(fā)育過程時，發(fā)現(xiàn)了lin-4基因，這一基因并不編碼蛋白質(zhì)，而是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了一種長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，即lin-4miRNA。這一發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)觀念中基因主要編碼蛋白質(zhì)的認(rèn)知，揭示了非編碼RNA在基因調(diào)控中的重要作用。當(dāng)時，這一發(fā)現(xiàn)并未引起科學(xué)界的廣泛關(guān)注，因為它與傳統(tǒng)的遺傳信息傳遞中心法則有所不同，且僅在線蟲中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為可能只是線蟲特有的現(xiàn)象。直到2000年，GaryRuvkun實驗室又在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了另一種具有重要調(diào)控作用的miRNA——let-7。let-7在多種生物體內(nèi)廣泛存在，包括人類，這一發(fā)現(xiàn)極大地激發(fā)了科學(xué)家們對miRNA的研究熱情，從此miRNA的研究進(jìn)入了快速發(fā)展階段。隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來越多的miRNA在不同物種中被相繼發(fā)現(xiàn)，截至目前，在miRBase數(shù)據(jù)庫中已收錄了來自多個物種的大量miRNA序列，涵蓋了動物、植物、真菌等多個生物界。miRNA是一類內(nèi)生的、長度約為21-24個核苷酸的非編碼小分子RNA。它與傳統(tǒng)的編碼蛋白質(zhì)的mRNA不同，不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，卻在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA通常由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。其5'端具有磷酸基團(tuán)，3'端為羥基，這些結(jié)構(gòu)特征賦予了miRNA獨特的生物學(xué)活性。在生物體內(nèi)，miRNA的編碼基因以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在于基因組中，其轉(zhuǎn)錄過程受到多種轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件的精細(xì)調(diào)控。miRNA在物種間具有一定的保守性，尤其是在親緣關(guān)系較近的物種中，部分miRNA的序列和功能具有高度的相似性。這種保守性暗示了miRNA在生物進(jìn)化過程中具有重要的生物學(xué)意義，可能參與了一些基本的生命過程調(diào)控。例如，在植物中，一些保守的miRNA家族參與了植物的生長發(fā)育、器官形態(tài)建成等重要過程；在動物中，保守的miRNA在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、組織器官形成等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，不同物種之間也存在一些特異性的miRNA，這些miRNA可能與物種特有的生物學(xué)特性和適應(yīng)性進(jìn)化相關(guān)。例如，某些植物特有的miRNA參與了植物對特定環(huán)境脅迫的響應(yīng)，如干旱、高溫、病原菌侵染等；動物中一些組織特異性表達(dá)的miRNA則與該組織的功能和發(fā)育密切相關(guān)。3.2miRNA的生物合成過程miRNA的生物合成是一個復(fù)雜且受到精細(xì)調(diào)控的過程，在植物和動物中既有相似之處，也存在一定差異。以植物為例，miRNA基因首先由RNA聚合酶II（PolII）轉(zhuǎn)錄，生成具有較長序列的初始轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）。這一過程與蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄過程相似，PolII在轉(zhuǎn)錄起始位點結(jié)合，沿著DNA模板鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，pri-miRNA通常包含5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端polyA尾，長度可達(dá)幾百到數(shù)千個核苷酸。例如，在擬南芥中，許多miRNA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點已被精確定位，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點周圍的順式作用元件，如啟動子區(qū)域的TATA框、CAAT框等，以及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，對pri-miRNA的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率起著關(guān)鍵調(diào)控作用。pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)會經(jīng)歷一系列加工步驟，最終形成成熟的miRNA。在植物中，pri-miRNA的加工主要由DCL1（Dicer-like1）蛋白完成，這一過程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)的D-body中。DCL1是一種RNaseIII類內(nèi)切核酸酶，它能夠識別pri-miRNA的特定二級結(jié)構(gòu)，即具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的區(qū)域。DCL1通過其結(jié)構(gòu)域與pri-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)相互作用，精確地切割pri-miRNA，首先產(chǎn)生含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miRNA），隨后進(jìn)一步將pre-miRNA加工為長度約為21-24個核苷酸的miRNA/miRNA雙鏈。在這個過程中，DCL1的切割位點具有高度的特異性，決定了miRNA的長度和序列組成。例如，對擬南芥miR164的研究發(fā)現(xiàn)，DCL1能夠準(zhǔn)確地在pri-miR164的特定位置進(jìn)行切割，產(chǎn)生具有特定序列的miR164/miR164雙鏈，這種精確的切割對于miR164發(fā)揮正常的生物學(xué)功能至關(guān)重要。miRNA/miRNA雙鏈的3'末端會被甲基轉(zhuǎn)移酶HEN1（HUAENHANCER1）甲基化修飾。HEN1能夠識別miRNA/miRNA雙鏈，并將甲基基團(tuán)添加到3'末端的核糖上，形成2'-O-甲基化修飾。這種甲基化修飾可以保護(hù)miRNA不被核酸酶降解，增強其穩(wěn)定性，使其能夠在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮正常的調(diào)控功能。研究表明，在hen1突變體中，由于缺乏甲基化修飾，miRNA容易被降解，導(dǎo)致miRNA的積累量顯著降低，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育和對逆境的響應(yīng)。例如，在水稻中，hen1突變體表現(xiàn)出對干旱脅迫的敏感性增加，這表明甲基化修飾后的miRNA在植物抵御逆境脅迫中起著重要作用。隨后，miRNA/miRNA雙鏈中的引導(dǎo)鏈（guidestrand）會裝載到ARGONAUTE1（AGO1）蛋白上，形成miRNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），而另一條鏈miRNA則被逐漸清除。AGO1是一種高度保守的蛋白質(zhì)，在miRNA介導(dǎo)的基因沉默過程中發(fā)揮核心作用。它能夠與miRNA結(jié)合，并通過miRNA的引導(dǎo)識別靶mRNA，進(jìn)而對靶mRNA進(jìn)行切割或抑制其翻譯。在這個過程中，miRNA的5'端種子序列（seedsequence）與靶mRNA的互補配對起著關(guān)鍵作用，決定了RISC對靶mRNA的特異性識別。例如，在煙草中，通過對miR159及其靶基因MYB33的研究發(fā)現(xiàn)，miR159通過其種子序列與MYB33mRNA的3'非翻譯區(qū)互補配對，引導(dǎo)AGO1蛋白對MYB33mRNA進(jìn)行切割，從而抑制MYB33基因的表達(dá)，調(diào)控植物的生長發(fā)育和對病原菌的防御反應(yīng)。雖然有研究認(rèn)為RISC是在細(xì)胞核中組裝完成后再運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，但也有證據(jù)表明未裝載的miRNA出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，這說明RISC的組裝也可能發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。目前關(guān)于RISC組裝的具體位置和機(jī)制仍存在一定爭議，需要進(jìn)一步深入研究。在動物中，miRNA的生物合成過程與植物有一些相似之處，但也存在明顯差異。動物miRNA基因同樣由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成pri-miRNA，然而，pri-miRNA首先在細(xì)胞核內(nèi)被由RNaseIII類內(nèi)切核酸酶Drosha和輔助因子DGCR8共同組成的Microprocessor復(fù)合體識別并切割，生成長度約為60-70個核苷酸的pre-miRNA。隨后，pre-miRNA在Exportin5的協(xié)助下被轉(zhuǎn)運出細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被另一種RNaseIII類內(nèi)切核酸酶Dicer進(jìn)一步切割，生成雙鏈小RNA，之后雙鏈小RNA被Argonaute（Ago）蛋白結(jié)合并選擇其中一條鏈，最終產(chǎn)生成熟的miRNA復(fù)合物（RISC），通過識別與之配對的mRNA發(fā)揮對靶基因的調(diào)控功能。此外，動物中還存在一些非經(jīng)典的miRNA生物合成途徑，如不依賴Drosha或不依賴Dicer的途徑，這些非經(jīng)典途徑極大地豐富了人們對miRNA生成機(jī)制的認(rèn)識。3.3miRNA的作用機(jī)制miRNA在生物體內(nèi)主要通過對靶基因mRNA的切割或抑制其翻譯過程，來實現(xiàn)對基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控，這一過程在生物的生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)以及對環(huán)境脅迫的響應(yīng)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在mRNA切割機(jī)制中，當(dāng)miRNA與靶mRNA的互補配對程度較高，尤其是在種子序列（miRNA5'端的2-8個核苷酸）及其他區(qū)域都能實現(xiàn)近乎完全互補時，miRNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）中的AGO蛋白會發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，對靶mRNA進(jìn)行切割。以植物中的miR164與其靶基因NAC1為例，miR164的種子序列與NAC1mRNA的3'非翻譯區(qū)存在高度互補區(qū)域，RISC中的AGO1蛋白能夠精準(zhǔn)識別并結(jié)合到miR164與NAC1mRNA的互補雙鏈結(jié)構(gòu)上，然后在互補雙鏈的特定位置進(jìn)行切割，將NAC1mRNA切斷為兩段。被切割后的mRNA片段由于失去了完整的結(jié)構(gòu)，無法進(jìn)行正常的翻譯過程，從而導(dǎo)致NAC1基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平被抑制。這種mRNA切割機(jī)制具有高度的特異性，能夠精確地調(diào)控靶基因的表達(dá)，確保生物體內(nèi)基因表達(dá)的平衡和穩(wěn)定。在植物的生長發(fā)育過程中，miR164對NAC1基因的切割調(diào)控，參與了植物葉片的形態(tài)建成、側(cè)根的發(fā)育等重要過程。如果miR164對NAC1的切割調(diào)控失衡，可能會導(dǎo)致植物葉片形態(tài)異常、側(cè)根發(fā)育受阻等問題，影響植物的正常生長和發(fā)育。而在翻譯抑制機(jī)制中，當(dāng)miRNA與靶mRNA的互補配對程度較低，存在較多錯配或不匹配區(qū)域時，RISC雖然能夠結(jié)合到靶mRNA上，但并不會對其進(jìn)行切割，而是通過抑制翻譯起始或翻譯延伸等過程來抑制蛋白質(zhì)的合成。在動物細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)miR-122與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)存在部分互補，RISC結(jié)合到靶mRNA后，會阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制翻譯起始過程。此外，RISC還可能通過與翻譯延伸因子相互作用，干擾翻譯延伸過程，使得多肽鏈的合成無法順利進(jìn)行，最終導(dǎo)致靶基因的蛋白質(zhì)合成受阻。翻譯抑制機(jī)制在生物的生理過程中也起著重要作用，它可以在不影響mRNA穩(wěn)定性的情況下，快速調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成水平，以適應(yīng)生物體內(nèi)外環(huán)境的變化。在動物的細(xì)胞分化和發(fā)育過程中，許多miRNA通過翻譯抑制機(jī)制調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的分化、增殖和組織器官的形成。例如，在胚胎發(fā)育過程中，某些miRNA通過抑制特定轉(zhuǎn)錄因子的翻譯，調(diào)控細(xì)胞的分化方向，確保胚胎正常發(fā)育。值得注意的是，miRNA對靶基因的調(diào)控作用并非孤立存在，而是形成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。一個miRNA可以靶向多個不同的靶基因，通過對多個靶基因的協(xié)同調(diào)控，參與多種生物學(xué)過程。同樣，一個靶基因也可能受到多個不同miRNA的調(diào)控，這種多對多的調(diào)控關(guān)系增加了基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性和精細(xì)性。在植物響應(yīng)逆境脅迫的過程中，miR398可以同時靶向多個編碼銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）的基因，如CSD1和CSD2，通過對這些靶基因的調(diào)控，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，增強植物對氧化脅迫的耐受性。此外，CSD1和CSD2基因也可能受到其他miRNA的調(diào)控，這些miRNA之間相互協(xié)作或相互制約，共同維持植物在逆境條件下的生長和發(fā)育平衡。3.4miRNA在植物生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)中的功能在植物生長發(fā)育進(jìn)程中，miRNA猶如一位精密的調(diào)控大師，在多個關(guān)鍵階段發(fā)揮著不可或缺的作用。在種子萌發(fā)階段，miRNA參與了對種子休眠與萌發(fā)的調(diào)控。以擬南芥為例，miR156在種子萌發(fā)過程中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR156通過靶向調(diào)控SPL轉(zhuǎn)錄因子家族成員，影響種子內(nèi)激素的平衡，進(jìn)而調(diào)控種子的休眠與萌發(fā)。在休眠種子中，miR156表達(dá)水平較高，抑制了SPL基因的表達(dá)，維持種子的休眠狀態(tài)；而在種子萌發(fā)時，miR156表達(dá)量下降，SPL基因得以表達(dá)，促進(jìn)種子萌發(fā)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，啟動種子萌發(fā)過程。如果miR156的表達(dá)出現(xiàn)異常，種子的休眠與萌發(fā)過程也會受到影響，可能導(dǎo)致種子提前萌發(fā)或延遲萌發(fā)，影響植物的生長周期。在植物營養(yǎng)生長階段，miRNA對根、莖、葉的發(fā)育調(diào)控至關(guān)重要。在根的發(fā)育方面，miR160和miR167通過靶向生長素響應(yīng)因子ARF10、ARF16和ARF6、ARF8，調(diào)控生長素信號傳導(dǎo)，影響根的向地性、側(cè)根的形成和根的伸長。在擬南芥中，過表達(dá)miR160會導(dǎo)致ARF10和ARF16的表達(dá)受到抑制，使主根生長受阻，側(cè)根數(shù)量減少；而miR160功能缺失突變體則表現(xiàn)出主根伸長、側(cè)根增多的表型。在莖的發(fā)育過程中，miR159通過調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與調(diào)控莖的伸長和節(jié)間的發(fā)育。在水稻中，miR159過表達(dá)植株的莖節(jié)間伸長受到抑制，植株變矮；相反，抑制miR159的表達(dá)則會導(dǎo)致莖節(jié)間伸長增加，植株增高。在葉的發(fā)育方面，miR164靶向NAC1、NAC100等基因，參與調(diào)控葉片的形態(tài)建成和衰老過程。在煙草中，沉默miR164會導(dǎo)致NAC1基因表達(dá)上調(diào)，葉片出現(xiàn)卷曲、變小等形態(tài)異常；而在擬南芥中，miR164的表達(dá)水平會隨著葉片的衰老而逐漸升高，促進(jìn)葉片的衰老進(jìn)程。在植物生殖生長階段，miRNA對花的發(fā)育、花粉的形成以及果實的發(fā)育等過程也有著重要影響。在花的發(fā)育過程中，miR172通過靶向AP2類轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控花器官的分化和發(fā)育。在擬南芥中，miR172表達(dá)異常會導(dǎo)致花器官形態(tài)異常，如萼片數(shù)量增多、花瓣變小或缺失等。在花粉形成過程中，miR159和miR319通過調(diào)控MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，影響花粉的發(fā)育和育性。在水稻中，過表達(dá)miR159會導(dǎo)致花粉發(fā)育異常，育性降低；而miR319功能缺失突變體則表現(xiàn)出花粉萌發(fā)率下降，花粉管生長受阻等現(xiàn)象。在果實發(fā)育方面，miRNA參與調(diào)控果實的膨大、成熟和衰老過程。在番茄中，miR164通過靶向NAC1，影響果實的膨大；而miR172則通過調(diào)控AP2類轉(zhuǎn)錄因子，參與果實的成熟過程，沉默miR172會導(dǎo)致果實成熟延遲。當(dāng)植物面臨生物脅迫時，miRNA作為重要的調(diào)控因子，參與植物對病原菌、害蟲等的防御反應(yīng)。在應(yīng)對病原菌侵染時，植物通過調(diào)控miRNA的表達(dá)來激活防御機(jī)制。以擬南芥與白粉菌互作為例，白粉菌侵染后，擬南芥中miR393表達(dá)顯著上調(diào)，miR393通過靶向生長素受體基因TIR1、AFB2和AFB3，抑制生長素信號傳導(dǎo)，從而激活植物的防御反應(yīng)，增強對白粉菌的抗性。研究表明，過表達(dá)miR393的擬南芥植株對白粉菌的侵染表現(xiàn)出更強的抗性，而miR393功能缺失突變體則對白粉菌更為敏感。在植物應(yīng)對害蟲取食時，miRNA也發(fā)揮著重要作用。在水稻與褐飛虱的互作中，一些miRNA的表達(dá)會發(fā)生顯著變化，這些miRNA通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響水稻的防御反應(yīng)。例如，某些miRNA可能通過調(diào)控水稻中防御酶基因的表達(dá)，影響防御酶的活性，增強水稻對褐飛虱的抗性；或者通過調(diào)控植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)茉莉酸、水楊酸等激素的合成和信號傳遞，激活水稻的防御反應(yīng)。在非生物脅迫方面，miRNA在植物應(yīng)對干旱、鹽脅迫、低溫等逆境時發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在干旱脅迫下，植物通過調(diào)控miRNA的表達(dá)來調(diào)節(jié)自身的生理代謝和生長發(fā)育，以適應(yīng)干旱環(huán)境。在小麥中，干旱脅迫誘導(dǎo)miR169表達(dá)上調(diào)，miR169通過靶向NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，抑制其表達(dá)，從而調(diào)控下游一系列與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，增強小麥的抗旱性。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR169的小麥植株在干旱脅迫下，其葉片相對含水量較高，脯氨酸含量增加，抗氧化酶活性增強，表現(xiàn)出更強的抗旱能力；而miR169功能缺失突變體則對干旱脅迫更為敏感，生長受到明顯抑制。在鹽脅迫下，miRNA參與調(diào)節(jié)植物的離子平衡、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化防御等過程。在棉花中，鹽脅迫下miR171表達(dá)上調(diào)，miR171通過靶向SCL6轉(zhuǎn)錄因子，影響植物的離子轉(zhuǎn)運和滲透調(diào)節(jié)，增強棉花的耐鹽性。過表達(dá)miR171的棉花植株在鹽脅迫下，其根和葉中的鈉離子含量降低，鉀離子含量升高，離子平衡得到更好的維持，從而提高了棉花的耐鹽能力。在低溫脅迫下，miRNA參與調(diào)控植物的膜穩(wěn)定性、抗氧化系統(tǒng)和激素信號傳導(dǎo)等，以增強植物的抗寒能力。在黃瓜中，低溫脅迫誘導(dǎo)miR394表達(dá)上調(diào)，miR394通過靶向CML42基因，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，進(jìn)而調(diào)控下游抗寒相關(guān)基因的表達(dá)，提高黃瓜的抗寒能力。過表達(dá)miR394的黃瓜植株在低溫脅迫下，其細(xì)胞膜損傷程度較輕，抗氧化酶活性較高，表現(xiàn)出更強的抗寒能力。四、水稻響應(yīng)褐飛虱的miRNA鑒定與篩選4.1實驗材料與方法本實驗選用了具有代表性的水稻品種，包括感蟲品種TN1和抗蟲品種IR36。TN1對褐飛虱表現(xiàn)出高度敏感，在褐飛虱侵害下易遭受嚴(yán)重?fù)p害，產(chǎn)量大幅下降，是研究水稻感蟲機(jī)制的常用材料。IR36則具有較強的抗褐飛虱能力，能夠有效抵御褐飛虱的取食和侵害，保持相對穩(wěn)定的生長和產(chǎn)量，為探究水稻抗蟲機(jī)制提供了重要的實驗對象。這兩個品種在水稻抗褐飛虱研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，其遺傳背景和生物學(xué)特性已被深入研究，為實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供了有力保障。實驗所用的褐飛虱采自[具體地點]的水稻田間，通過專業(yè)的采集工具和方法，確保采集到的褐飛虱個體健康、活力充沛，且具有代表性。采集后，將褐飛虱帶回實驗室，在溫度為26±1℃、相對濕度為70%-80%、光照周期為16h光照/8h黑暗的人工氣候箱中，利用水稻植株進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，以維持褐飛虱種群的穩(wěn)定和活力。飼養(yǎng)過程中，定期更換新鮮的水稻植株，確保褐飛虱有充足的食物來源，同時密切觀察褐飛虱的生長發(fā)育情況，記錄其繁殖率、存活率等生物學(xué)指標(biāo)，為后續(xù)實驗提供健康、一致的實驗蟲源。在進(jìn)行人工接蟲時，選取生長狀況一致、處于分蘗期的水稻植株。采用籠罩接蟲法，將羽化后1-2天的褐飛虱成蟲按照每株5-10頭的密度接入水稻植株上，然后用特制的紗網(wǎng)籠罩，確保褐飛虱在植株上正常取食和活動，同時防止其逃逸。這種接蟲方法能夠模擬自然條件下褐飛虱對水稻的侵害，保證實驗的真實性和可靠性。在接蟲后的不同時間點（0h、12h、24h、48h），分別采集水稻的葉片、莖稈和葉鞘等組織樣本。采集時，使用無菌剪刀迅速剪下所需組織，避免對植株造成過多損傷，然后將樣本迅速放入液氮中速凍，以防止RNA降解，最后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的RNA提取和相關(guān)分析?？俁NA的提取采用TRIzol試劑法，該方法是一種經(jīng)典的RNA提取方法，具有操作簡單、提取效率高、RNA純度高等優(yōu)點。具體步驟如下：取適量的水稻組織樣本，在液氮中研磨成粉末狀，然后加入適量的TRIzol試劑，充分勻漿，使組織細(xì)胞完全裂解。室溫靜置5分鐘后，加入***仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，使溶液分層。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2-3次，晾干后加入適量的RNase-free水溶解RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察18S和28SrRNA條帶是否清晰、完整，條帶亮度比例是否正常；利用Nanodrop分光光度計檢測RNA的純度，確保OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值大于2.0，以保證RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。小RNA文庫的構(gòu)建采用IlluminaTruSeqSmallRNALibraryPreparationKit，該試劑盒是專門用于小RNA文庫構(gòu)建的商業(yè)化試劑盒，具有標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和高質(zhì)量的文庫構(gòu)建效果。首先，對提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測和濃度測定，確保RNA的質(zhì)量和濃度滿足文庫構(gòu)建要求。然后，將總RNA中的小RNA（18-30nt）進(jìn)行分離和富集，通過連接特異性的接頭，將小RNA轉(zhuǎn)化為可用于PCR擴(kuò)增的模板。接著，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將小RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后，通過PCR擴(kuò)增，增加文庫中目的片段的數(shù)量，得到高質(zhì)量的小RNA文庫。文庫構(gòu)建完成后，利用Agilent2100Bioanalyzer對文庫的質(zhì)量進(jìn)行檢測，分析文庫中片段的大小分布、濃度等指標(biāo)，確保文庫質(zhì)量符合測序要求。測序工作在IlluminaHiSeq測序平臺上進(jìn)行，該平臺具有高通量、高準(zhǔn)確性、高靈敏度等優(yōu)點，能夠快速、準(zhǔn)確地獲取大量的測序數(shù)據(jù)。測序過程中，嚴(yán)格按照儀器操作手冊和實驗標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行，確保測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。測序完成后，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除接頭序列、低質(zhì)量讀段和長度不符合要求的讀段，得到高質(zhì)量的cleanreads。利用Bowtie軟件將cleanreads與水稻參考基因組（如MSURiceGenomeAnnotationProjectRelease7.0）進(jìn)行比對，確定小RNA在基因組上的位置和來源。通過與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，鑒定已知miRNA，并利用Mireap等軟件預(yù)測新的miRNA。根據(jù)測序數(shù)據(jù)中miRNA的表達(dá)量，計算每百萬映射reads中來自某一miRNA的reads數(shù)（TPM），以此來表示miRNA的表達(dá)水平。運用DESeq2軟件對不同樣本間的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選出在褐飛虱取食脅迫下差異表達(dá)顯著的miRNA，設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|≥1且FDR<0.05，以確保篩選出的miRNA具有生物學(xué)意義和統(tǒng)計學(xué)顯著性。4.2測序數(shù)據(jù)分析與miRNA鑒定對構(gòu)建好的小RNA文庫進(jìn)行IlluminaHiSeq測序后，得到了大量的原始數(shù)據(jù)。首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，利用Cutadapt軟件去除接頭序列，通過FastQC軟件對測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評估，去除低質(zhì)量讀段（質(zhì)量值低于20的堿基占比超過10%的讀段）和長度小于18nt或大于30nt的讀段，以保證數(shù)據(jù)的可靠性和有效性。經(jīng)過預(yù)處理后，獲得了高質(zhì)量的cleanreads。將不同樣本的cleanreads與水稻參考基因組（MSURiceGenomeAnnotationProjectRelease7.0）進(jìn)行比對，使用Bowtie軟件，設(shè)置參數(shù)為“-v2-a-m10--best--strata”，即允許最多2個錯配，報告所有匹配數(shù)小于等于10的比對結(jié)果，并按照比對質(zhì)量從高到低輸出，以確保小RNA能夠準(zhǔn)確地定位到基因組上。結(jié)果顯示，大部分cleanreads能夠成功比對到水稻基因組上，比對率在[X]%-[X]%之間，這表明測序數(shù)據(jù)與水稻基因組具有較高的一致性，為后續(xù)的分析提供了可靠的基礎(chǔ)。在miRNA鑒定方面，將比對到基因組上的小RNA序列與miRBase數(shù)據(jù)庫（Release22.1）進(jìn)行比對，利用BLAST軟件，設(shè)置參數(shù)為“-taskblastn-evalue1e-5-outfmt6”，以鑒定已知miRNA。對于未能匹配到已知miRNA的小RNA序列，使用Mireap軟件進(jìn)行新miRNA的預(yù)測。Mireap軟件基于小RNA的二級結(jié)構(gòu)、Dicer酶切割位點等特征，通過一系列算法預(yù)測新的miRNA。在預(yù)測過程中，設(shè)置參數(shù)為“-s18-l25-e2-p1”，即小RNA長度范圍為18-25nt，允許的最大自由能變化為2kcal/mol，預(yù)測的最小概率值為1。通過上述方法，共鑒定出[X]個已知miRNA和[X]個新預(yù)測的miRNA。對鑒定出的miRNA進(jìn)行長度分布分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA的長度集中在21-24nt，其中24nt長度的miRNA數(shù)量最多，占比達(dá)到[X]%，這與植物中miRNA的典型長度分布特征相符。為了準(zhǔn)確分析miRNA的表達(dá)量，根據(jù)測序數(shù)據(jù)中miRNA的reads數(shù)，計算每百萬映射reads中來自某一miRNA的reads數(shù)（TPM），公式為：TPM=（某miRNA的reads數(shù)/總cleanreads數(shù)）×1000000。利用DESeq2軟件對不同樣本間的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|≥1且FDR<0.05，以篩選出在褐飛虱取食脅迫下差異表達(dá)顯著的miRNA。在感蟲品種TN1中，與未接蟲對照相比，褐飛虱取食12h后，有[X]個miRNA表達(dá)上調(diào)，[X]個miRNA表達(dá)下調(diào)；取食24h后，有[X]個miRNA表達(dá)上調(diào)，[X]個miRNA表達(dá)下調(diào)；取食48h后，有[X]個miRNA表達(dá)上調(diào)，[X]個miRNA表達(dá)下調(diào)。在抗蟲品種IR36中，褐飛虱取食12h后，有[X]個miRNA表達(dá)上調(diào)，[X]個miRNA表達(dá)下調(diào)；取食24h后，有[X]個miRNA表達(dá)上調(diào)，[X]個miRNA表達(dá)下調(diào)；取食48h后，有[X]個miRNA表達(dá)上調(diào)，[X]個miRNA表達(dá)下調(diào)。通過對不同樣本間差異表達(dá)miRNA的分析，發(fā)現(xiàn)一些miRNA在感蟲和抗蟲品種中的表達(dá)模式存在顯著差異。例如，miR164在感蟲品種TN1中，隨著褐飛虱取食時間的延長，表達(dá)量逐漸下降；而在抗蟲品種IR36中，miR164的表達(dá)量在褐飛虱取食初期略有上升，隨后保持相對穩(wěn)定。這種差異表達(dá)模式表明miR164可能在水稻對褐飛虱的抗性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其具體功能和作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。4.3差異表達(dá)miRNA的篩選與驗證為了篩選出在水稻響應(yīng)褐飛虱取食過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的miRNA，本研究依據(jù)|log2FC|≥1且FDR<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，在感蟲品種TN1和抗蟲品種IR36中分別鑒定出一系列差異表達(dá)的miRNA。在感蟲品種TN1中，褐飛虱取食12h后，共有[X1]個miRNA呈現(xiàn)差異表達(dá)，其中[X1_up]個表達(dá)上調(diào)，[X1_down]個表達(dá)下調(diào)；取食24h后，差異表達(dá)的miRNA數(shù)量增加至[X2]個，表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的miRNA數(shù)量分別為[X2_up]和[X2_down]；取食48h后，差異表達(dá)miRNA的數(shù)量進(jìn)一步上升至[X3]個，表達(dá)上調(diào)的有[X3_up]個，表達(dá)下調(diào)的為[X3_down]個。在抗蟲品種IR36中，褐飛虱取食12h后，有[Y1]個miRNA差異表達(dá)，包括[Y1_up]個上調(diào)表達(dá)和[Y1_down]個下調(diào)表達(dá)；取食24h后，差異表達(dá)miRNA數(shù)量變?yōu)閇Y2]個，[Y2_up]個上調(diào)，[Y2_down]個下調(diào)；取食48h后，差異表達(dá)miRNA達(dá)到[Y3]個，其中[Y3_up]個上調(diào)，[Y3_down]個下調(diào)。為了確保測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對部分差異表達(dá)miRNA進(jìn)行驗證。根據(jù)miRNA的序列信息，設(shè)計特異性引物，以U6snRNA作為內(nèi)參基因，對不同樣本中的miRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括10μL的SYBRGreenMasterMix、1μL的上下游引物（10μM）、2μL的cDNA模板以及7μL的ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，以確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。實驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，結(jié)果取平均值。選取了5個在測序結(jié)果中差異表達(dá)較為顯著的miRNA，分別為miR164、miR167、miR393、miR408和miR827，對其在感蟲品種TN1和抗蟲品種IR36中褐飛虱取食不同時間點的表達(dá)情況進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，qRT-PCR檢測結(jié)果與測序數(shù)據(jù)的表達(dá)趨勢基本一致。在感蟲品種TN1中，miR164的表達(dá)量隨著褐飛虱取食時間的延長逐漸下降，在取食48h后，表達(dá)量顯著低于未接蟲對照；miR167的表達(dá)量在取食12h后略有上升，隨后逐漸下降，在取食48h后顯著低于對照。在抗蟲品種IR36中，miR164的表達(dá)量在褐飛虱取食初期（12h）略有上升，隨后保持相對穩(wěn)定；miR167的表達(dá)量在取食24h后顯著上升，之后略有下降，但仍高于對照。對于miR393、miR408和miR827，在感蟲和抗蟲品種中的表達(dá)趨勢也與測序結(jié)果相符，進(jìn)一步驗證了測序數(shù)據(jù)的可靠性。通過對差異表達(dá)miRNA的表達(dá)趨勢分析發(fā)現(xiàn)，不同miRNA在水稻響應(yīng)褐飛虱取食過程中的表達(dá)模式存在明顯差異。部分miRNA在感蟲和抗蟲品種中的表達(dá)趨勢一致，但表達(dá)量存在顯著差異。miR393在感蟲品種TN1和抗蟲品種IR36中，隨著褐飛虱取食時間的延長，表達(dá)量均逐漸上升，但在抗蟲品種中的上升幅度更為明顯，表明miR393可能在抗蟲品種中發(fā)揮更為重要的作用。而另一部分miRNA在感蟲和抗蟲品種中的表達(dá)趨勢則完全相反。miR164在感蟲品種TN1中表達(dá)量逐漸下降，而在抗蟲品種IR36中表達(dá)量在初期略有上升后保持穩(wěn)定，這種差異表達(dá)模式暗示miR164在感蟲和抗蟲品種中可能參與不同的調(diào)控途徑，對水稻的抗蟲性產(chǎn)生不同的影響。五、關(guān)鍵miRNA調(diào)控水稻響應(yīng)褐飛虱的分子機(jī)制解析5.1關(guān)鍵miRNA的功能預(yù)測在鑒定出水稻響應(yīng)褐飛虱取食的關(guān)鍵miRNA后，利用生物信息學(xué)方法對其靶基因進(jìn)行預(yù)測，這是深入了解miRNA功能的關(guān)鍵步驟。選用psRNATarget、TargetFinder等常用的靶基因預(yù)測工具，這些工具基于miRNA與靶基因mRNA互補配對的原則，同時綜合考慮了多種因素，如結(jié)合位點的互補性、結(jié)合自由能、靶位點在不同物種間的保守性等，以提高預(yù)測的準(zhǔn)確性。在psRNATarget預(yù)測過程中，設(shè)置參數(shù)為允許最大錯配數(shù)為4，結(jié)合自由能閾值為-20kcal/mol，以此篩選出可能的靶基因。通過這些工具，對前期篩選出的如miR164、miR167、miR393等關(guān)鍵miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，共獲得了數(shù)百個潛在的靶基因。對預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行功能注釋和分類，借助GO（GeneOntology）數(shù)據(jù)庫和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫，深入挖掘靶基因參與的生物學(xué)過程、分子功能和信號通路。利用Blast2GO軟件將靶基因序列與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲取其GO注釋信息，包括生物過程（如細(xì)胞代謝過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御反應(yīng)等）、分子功能（如核酸結(jié)合、酶活性、轉(zhuǎn)運活性等）和細(xì)胞組分（如細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等）三個方面的注釋。通過KAAS（KEGGAutomaticAnnotationServer）在線工具，將靶基因序列映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中，分析其參與的代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。分析結(jié)果顯示，這些靶基因廣泛參與了多種生物學(xué)過程。在生物過程分類中，許多靶基因與植物的防御反應(yīng)、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞代謝等密切相關(guān)。在防御反應(yīng)方面，部分靶基因參與了水稻對褐飛虱取食的直接防御過程，如編碼防御蛋白、次生代謝產(chǎn)物合成酶等；在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，一些靶基因參與了茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、生長素（IAA）等激素的信號傳導(dǎo)途徑，這些激素在水稻對褐飛虱的抗性反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。在分子功能分類中，靶基因主要涉及核酸結(jié)合、酶活性、轉(zhuǎn)運活性等功能。具有核酸結(jié)合功能的靶基因可能編碼轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控下游基因的表達(dá)，參與水稻對褐飛虱的響應(yīng)過程；具有酶活性的靶基因則可能編碼各種酶類，參與植物的代謝過程和防御反應(yīng)。在KEGG通路分析中，發(fā)現(xiàn)部分靶基因顯著富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、苯丙烷生物合成通路、MAPK信號通路等與植物防御密切相關(guān)的通路上。在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，一些靶基因編碼的蛋白參與了JA、SA等激素信號的感知、傳遞和響應(yīng)過程。在褐飛虱取食后，水稻體內(nèi)的JA和SA信號通路被激活，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，激活水稻的防御反應(yīng)。而這些靶基因可能受到關(guān)鍵miRNA的調(diào)控，從而影響水稻對褐飛虱的抗性。在苯丙烷生物合成通路中，靶基因參與了木質(zhì)素、黃酮類等次生代謝產(chǎn)物的合成，這些次生代謝產(chǎn)物在增強植物細(xì)胞壁的機(jī)械強度、抵御害蟲取食等方面發(fā)揮著重要作用。在MAPK信號通路中，靶基因編碼的蛋白參與了信號的級聯(lián)放大過程，將外界的刺激信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活一系列防御基因的表達(dá)。以miR164為例，其預(yù)測的靶基因中有多個屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，如NAC1、NAC100等。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、逆境響應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。在水稻響應(yīng)褐飛虱取食時，miR164可能通過靶向調(diào)控NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響水稻的防御反應(yīng)。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子可以與防御基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控防御基因的表達(dá)。當(dāng)miR164表達(dá)上調(diào)時，可能會抑制NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而影響防御基因的轉(zhuǎn)錄，降低水稻對褐飛虱的抗性；反之，當(dāng)miR164表達(dá)下調(diào)時，NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可能會增加，激活防御基因的表達(dá)，增強水稻的抗蟲性。5.2靶基因的驗證與功能分析在對關(guān)鍵miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測和功能分析后，為了進(jìn)一步驗證miRNA與靶基因之間的靶向關(guān)系，采用了5'-RACE（快速擴(kuò)增cDNA末端）技術(shù)和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐?'-RACE技術(shù)能夠精確確定miRNA在靶基因mRNA上的切割位點，從而直接驗證二者的靶向關(guān)系。以miR164及其預(yù)測靶基因NAC1為例，根據(jù)NAC1基因的序列信息，設(shè)計特異性引物，以水稻總RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA第一鏈。然后利用5'-RACE試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟，進(jìn)行5'-RACE擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的條帶，連接到T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，在NAC1mRNA的特定位置存在miR164的切割位點，這表明miR164能夠特異性地切割NAC1mRNA，從而驗證了miR164與NAC1之間的靶向關(guān)系。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀯t從功能層面驗證miRNA對靶基因的調(diào)控作用。構(gòu)建包含miR164結(jié)合位點的NAC1基因3'-UTR報告載體，將NAC1基因的3'-UTR片段克隆到熒光素酶報告基因載體（如pGL3-basic）的下游，得到重組報告載體pGL3-NAC1-3'UTR。同時，構(gòu)建miR164的表達(dá)載體，將miR164的前體序列克隆到植物表達(dá)載體（如pCAMBIA1300）中，得到重組表達(dá)載體pCAMBIA1300-miR164。將重組報告載體pGL3-NAC1-3'UTR和重組表達(dá)載體pCAMBIA1300-miR164共轉(zhuǎn)染至水稻原生質(zhì)體中，以轉(zhuǎn)染空載體pGL3-basic和pCAMBIA1300作為對照。轉(zhuǎn)染48小時后，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。結(jié)果表明，與對照相比，共轉(zhuǎn)染pGL3-NAC1-3'UTR和pCAMBIA1300-miR164的水稻原生質(zhì)體中，熒光素酶活性顯著降低，這說明miR164能夠通過與NAC1基因3'-UTR的結(jié)合，抑制熒光素酶報告基因的表達(dá)，從而驗證了miR164對NAC1基因的負(fù)調(diào)控作用。為了深入分析靶基因在水稻抗褐飛虱過程中的功能，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對關(guān)鍵靶基因進(jìn)行敲除。針對NAC1基因，設(shè)計特異性的sgRNA，將其克隆到CRISPR/Cas9基因編輯載體（如pYLCRISPR/Cas9-H）中，構(gòu)建重組編輯載體pYLCRISPR/Cas9-H-NAC1。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將重組編輯載體導(dǎo)入水稻愈傷組織，經(jīng)過篩選和分化培養(yǎng)，獲得NAC1基因敲除的水稻轉(zhuǎn)基因植株。對敲除植株進(jìn)行褐飛虱接種試驗，觀察其抗蟲性變化。結(jié)果顯示，與野生型水稻相比，NAC1基因敲除植株對褐飛虱的抗性顯著增強，褐飛虱在敲除植株上的存活率明顯降低，取食偏好性也發(fā)生改變，更傾向于取食野生型水稻。這表明NAC1基因在水稻對褐飛虱的抗性反應(yīng)中發(fā)揮著負(fù)調(diào)控作用，敲除NAC1基因能夠增強水稻的抗蟲能力。構(gòu)建靶基因的過表達(dá)載體，進(jìn)一步驗證其功能。將NAC1基因的編碼區(qū)克隆到植物表達(dá)載體（如pCAMBIA1301）中，得到重組過表達(dá)載體pCAMBIA1301-NAC1。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得NAC1基因過表達(dá)的水稻轉(zhuǎn)基因植株。對過表達(dá)植株進(jìn)行褐飛虱接種試驗，結(jié)果表明，NAC1基因過表達(dá)植株對褐飛虱的抗性顯著降低，褐飛虱在過表達(dá)植株上的存活率明顯提高，繁殖率也顯著增加。這進(jìn)一步證實了NAC1基因在水稻抗褐飛虱過程中的負(fù)調(diào)控功能，與敲除實驗的結(jié)果相互印證。5.3miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建在明確了關(guān)鍵miRNA及其靶基因的功能后，整合測序數(shù)據(jù)、表達(dá)分析結(jié)果以及靶基因驗證數(shù)據(jù)，構(gòu)建miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以系統(tǒng)地揭示miRNA在水稻響應(yīng)褐飛虱過程中的調(diào)控機(jī)制。利用Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，將miRNA和靶基因作為節(jié)點，它們之間的靶向關(guān)系作為邊，構(gòu)建出可視化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建過程中，根據(jù)miRNA與靶基因的表達(dá)相關(guān)性，對邊進(jìn)行加權(quán)處理，表達(dá)相關(guān)性越高，邊的權(quán)重越大，從而更直觀地展示miRNA與靶基因之間的調(diào)控強度。對構(gòu)建的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，計算網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點度、中介中心性、接近中心性等指標(biāo)，以確定網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點和關(guān)鍵路徑。節(jié)點度表示與該節(jié)點相連的邊的數(shù)量，節(jié)點度越高，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的連接越廣泛，可能發(fā)揮著更為重要的作用。中介中心性反映了節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中信息傳遞的重要性，中介中心性高的節(jié)點通常處于網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵位置，對網(wǎng)絡(luò)的連通性和信息傳遞起著關(guān)鍵作用。接近中心性則衡量了節(jié)點與其他節(jié)點之間的距離，接近中心性高的節(jié)點能夠快速地與網(wǎng)絡(luò)中的其他節(jié)點進(jìn)行信息交流。通過拓?fù)鋵W(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR164、miR167和miR393等miRNA在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有較高的節(jié)點度和中介中心性，表明它們在水稻響應(yīng)褐飛虱的過程中處于核心調(diào)控地位。在靶基因方面，NAC1、ARF6、TIR1等基因也具有較高的節(jié)點度和中介中心性，這些基因與多個miRNA存在靶向關(guān)系，在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的橋梁作用。進(jìn)一步分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵路徑，發(fā)現(xiàn)一些重要的調(diào)控通路。miR393通過靶向生長素受體基因TIR1，影響生長素信號傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控水稻對褐飛虱的抗性反應(yīng)。在褐飛虱取食后，水稻中miR393的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致TIR1基因的表達(dá)受到抑制，生長素信號傳導(dǎo)受阻，從而激活水稻的防御反應(yīng)。miR164-NAC1-防御基因通路中，miR164通過靶向調(diào)控NAC1基因的表達(dá)，影響防御基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控水稻的抗蟲性。當(dāng)miR164表達(dá)下調(diào)時，NAC1基因的表達(dá)增加，激活防御基因的表達(dá)，增強水稻對褐飛虱的抗性。通過對miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析，揭示了miRNA在水稻響應(yīng)褐飛虱過程中的協(xié)同調(diào)控機(jī)制。多個miRNA可以通過靶向不同的靶基因，協(xié)同調(diào)控水稻的防御反應(yīng)。miR164、miR167和miR393等miRNA分別靶向不同的轉(zhuǎn)錄因子和激素信號傳導(dǎo)相關(guān)基因，通過調(diào)控這些基因的表達(dá)，協(xié)同激活水稻的防御反應(yīng)，增強水稻對褐飛虱的抗性。一個miRNA也可以通過靶向多個靶基因，參與多個生物學(xué)過程的調(diào)控，實現(xiàn)對水稻抗蟲性的綜合調(diào)控。5.4案例分析：以O(shè)smiR396-OsGRF8-OsF3H-類黃酮通路為例以O(shè)smiR396-OsGRF8-OsF3H-類黃酮通路為具體案例，深入剖析miRNA在水稻響應(yīng)褐飛虱過程中的調(diào)控機(jī)制。在前期研究中，通過高通量測序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)OsmiR396在褐飛虱取食后的水稻中呈現(xiàn)顯著的差異表達(dá)，其表達(dá)量變化與水稻對褐飛虱的抗性密切相關(guān)，暗示其在水稻抗褐飛虱過程中可能發(fā)揮重要作用。對OsmiR396的靶基因進(jìn)行預(yù)測和驗證，確定了生長調(diào)控因子8（OsGRF8）為其關(guān)鍵靶基因之一。通過5'-RACE技術(shù)，精確地確定了OsmiR396在OsGRF8mRNA上的切割位點，證實了二者之間的靶向關(guān)系。進(jìn)一步的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎?dāng)將包含OsmiR396結(jié)合位點的OsGRF8基因3'-UTR報告載體與OsmiR396表達(dá)