第八章酶免疫技術(shù)第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)第二節(jié)酶免疫技術(shù)的分類第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第四節(jié)酶免疫測定的應(yīng)用放射免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)識技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)識技術(shù)

第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)

重要試劑:酶標(biāo)識的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)：免疫學(xué)活性酶對底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性、敏感性原理及特點(diǎn)特點(diǎn)：敏捷度高、特異性強(qiáng)、精確性好酶標(biāo)識試劑穩(wěn)定操作簡便、無污染易衍生新措施原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析

原理及特點(diǎn)標(biāo)識酶的規(guī)定：活性高性質(zhì)穩(wěn)定專一性強(qiáng)酶催化底物的顯色信號易于判斷和檢測措施敏感，反復(fù)性好，簡樸易行酶的底物易配制保留酶及底物價(jià)格低廉對人體無損傷、對環(huán)境無污染

一、酶和酶作用底物常用酶酶和酶作用底物辣根過氧化物酶（HRP）

堿性磷酸酶（AP）β-半乳糖苷酶（β-Gal）

ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)識用酶HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

酶和酶作用底物AP的底物

β-Gal的底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸取峰波長為405nm。酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測量。常用底物酶和酶作用底物抗原規(guī)定純度高，抗原性完整抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。

制備措施規(guī)定酶標(biāo)識抗體或抗原制備措施規(guī)定技術(shù)措施簡樸、產(chǎn)率高，反復(fù)性好標(biāo)識反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性酶標(biāo)識物穩(wěn)定，不形成聚合物酶標(biāo)識抗體或抗原制備措施過碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標(biāo)識抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法酶標(biāo)識抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個(gè)相似的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)識效率比一步法高，酶標(biāo)識物質(zhì)量較均一。酶標(biāo)識抗體或抗原純化及鑒定標(biāo)識完畢后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，防止游離酶增長非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而減少特異性染色強(qiáng)度常用的純化措施：葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純酶標(biāo)識抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標(biāo)識物迅速分離的最常用措施固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面

三、固相載體規(guī)定結(jié)合抗體或抗原的容量大抗體或抗原牢固地固定在其表面不影響免疫反應(yīng)性利于反應(yīng)充足進(jìn)行固相措施簡便易行，迅速經(jīng)濟(jì)種類塑料制品

微顆粒膜載體

固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附包被coating封閉blocking包被與封閉

第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類

酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其他標(biāo)本中抗原的定位液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定酶標(biāo)識物與對應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)識酶的活性會(huì)發(fā)生變化，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)識物，通過測定標(biāo)識酶的活性的變化，而確定抗原或抗體的含量。原理一、均相酶免疫測定最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫測定EMIT示意圖CEDIA示意圖分類：液相酶免疫測定固相酶免疫測定以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是目前最為常用的固相酶免疫測定與均相不一樣之處需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)識物二、非均相酶免疫測定

第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

原理一、基本原理將抗原或抗體固化，加入待檢樣本和酶標(biāo)識的抗體或抗原一起反應(yīng)，洗掉未結(jié)合的物質(zhì)，加入底物顯色，檢測待檢物質(zhì)的含量。底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234一、基本原理固相的抗原或抗體

酶標(biāo)識物（酶結(jié)合物）酶反應(yīng)的底物

三個(gè)必要試劑（試劑盒的重要成分）二、措施類型及反應(yīng)原理雙抗體夾心法措施：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測抗原的措施1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY競爭法

措施：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一種抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測抗原的措施洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競爭與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YE間接法措施用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。長處一種酶標(biāo)抗抗體檢測多種與抗原對應(yīng)的抗體應(yīng)用常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定ELISA檢測抗體的措施1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作環(huán)節(jié)：類似應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體的措施競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法

應(yīng)用：乙型肝炎病毒關(guān)鍵抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測ELISA檢測抗體的措施競爭法檢測HBeAb:在微孔上預(yù)先包被HBeAb（第一抗體），以HRP-HBeAb為第二抗體，中和抗原（HBeAg）起到橋接作用，形成雙抗體夾抗原復(fù)合物，最終顯色。假如待檢樣本中具有HBeAb，則與HRP-HBeAb競爭結(jié)合中和抗原，制止HRP-HBeAb形成復(fù)合物，最終不顯色。因此，競爭法檢測HBeAb時(shí)，顯色為陰性，不顯色為陽性。競爭法測抗原+-YYYYYYEYYYYYYEYEYE中和抗原橋接結(jié)合酶標(biāo)抗體加酶作用底物顯色加酶作用不顯色或顯色弱包被已知抗體待測抗體與酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合中和抗原YEYYYEEYYYYYYYEYYYYYYEYYE包被已知抗體競爭法檢測HBcAb:在微孔上預(yù)先包被HBcAg，HRP-HBcAb可以與HBcAg結(jié)合，形成抗體抗原復(fù)合物而顯色。假如待檢樣本中具有HBcAb，則與HRP-HBcAb競爭結(jié)合包被的HBcAg，克制HRP-HBcAb與HBcAg的結(jié)合，最終不顯色。因此，競爭克制法檢測HBcAb時(shí)，顯色為陰性，不顯色為陽性。競爭法測抗體+YYYYYEY加酶作用的底物不顯色或顯色弱已知抗原包被YEYE待檢抗體與酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被抗原-EYYEYEYEYE加酶作用的底物顯色YE已知抗原包被無待檢抗體與酶標(biāo)抗體競爭捕捉法應(yīng)用：病原體急性感染診斷中的IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒關(guān)鍵HBc-IgM抗體ELISA檢測抗體的措施捕捉法原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕捉待測標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)識特異性抗原的抗體底物顯色洗滌洗滌洗滌洗滌捕捉法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色

第四節(jié)

酶免疫測定的應(yīng)用

均相酶免疫測定重要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測。非均相免疫測定中的ELISA廣泛用于傳染病的診斷，肝炎系列、HIV、TP等。多種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物測定。1．酶免疫技術(shù)的重要特點(diǎn)？2．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理（ELISA）？3．ELISA的非特異性干擾有哪些，其機(jī)制？4．對酶免疫技術(shù)的應(yīng)用評價(jià)怎樣？5.假如需要檢測樣本中的抗原，你可以選擇哪些類型ELISA措施進(jìn)行檢測？檢測原理分別是什么？思索題酶免疫技術(shù)是標(biāo)識免疫技術(shù)的一種，它是以酶標(biāo)識的抗原或抗體作為重要試劑的免疫檢測措施，在抗原與抗體的特異性反應(yīng)完畢后，通過酶對底物的作用深入提高敏感性。酶免疫技術(shù)可分為酶免疫組織化學(xué)技術(shù)和酶免疫測定兩大類,后者根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后與否需要分離結(jié)合與游離的酶標(biāo)識物而分為均相和非均相兩種類型。均相酶免疫測定重要用于小分子激素和半抗原的測定，非均相酶免疫測定根據(jù)與否使用固相支持物，又可分為液相和固相酶免疫測定兩種類型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,其原理可以有夾心法、競爭法、間接法和捕捉法等。小結(jié)第十章

生物素-親合素放大技術(shù)維生素H動(dòng)、植物組織中廣泛分布,卵黃和肝含量高M(jìn)W244.31kD.I環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合素結(jié)合Ⅱ環(huán)為噻吩環(huán)，C2上戊酸側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生物大分子的唯一構(gòu)造I咪唑酮環(huán)

Ⅱ噻吩環(huán)

羧基第一節(jié)生物素理化性質(zhì)與標(biāo)識一、活化生物素生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學(xué)修飾后制成帶多種活性基團(tuán)的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)生物素活化活化生物素易與抗原、抗體酶及核酸分子中對應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)識物標(biāo)識蛋白質(zhì)氨基的活化生物素標(biāo)識蛋白質(zhì)醛基的活化生物素標(biāo)識蛋白質(zhì)巰基的活化生物素標(biāo)識核酸的活化生物素活化生物素標(biāo)識蛋白質(zhì)氨基的活化生物素BNHS分子可與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基形成肽鍵BNHS合用標(biāo)識抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì)生物素N-羥基丁二酰胺碳二亞胺生物素羥基琥珀酰亞胺酯（BNHS）怎樣減小空間位阻？長臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個(gè)6-氨基已糖分子基團(tuán)，形成連結(jié)臂，生物素與大分子基團(tuán)的距離標(biāo)識蛋白質(zhì)醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物重要用于標(biāo)識偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素與賴氨酸連接后，再與無水肼反應(yīng)而成。除醛基外，BCHZ還可標(biāo)識氨基標(biāo)識蛋白質(zhì)巰基的活化生物素馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素標(biāo)識核酸的活化生物素光敏生物素(photobiotin)側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團(tuán),經(jīng)光照后變?yōu)榉枷慊趸剑芍苯优c腺嘌呤氨基結(jié)合,形成核酸探針，用于DNA或RNA的標(biāo)識。生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作為TTP的構(gòu)造類似物，可采用缺口移位法摻入到雙鏈DNA中。BNHS和BHZ可直接標(biāo)識核酸，但對堿基配對有影響。活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接；一種蛋白分子可被多種生物素標(biāo)識－多價(jià)性；對BNHS多標(biāo)識抗體,BHZ則多標(biāo)識微酸性抗原；抗原、抗體標(biāo)識后活性不變；可對標(biāo)識材料（如酶）標(biāo)識：堿性磷酸酶標(biāo)識后活性將減少；二、生物素標(biāo)識蛋白質(zhì)選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標(biāo)識基團(tuán)的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素與蛋白質(zhì)的比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜為2:1,IgG應(yīng)用濃度0.5~5μg/ml;生物素1~3個(gè)/Ag，3~5個(gè)/Ab；使用交聯(lián)臂減少空間阻力第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)識親合素(avidin,AV)和鏈霉親合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特異性結(jié)合物。并且，兩者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標(biāo)識的物質(zhì)均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素（SA）結(jié)合。構(gòu)造四亞基糖蛋白四肽鏈蛋白無糖基PI10.56結(jié)合位色氨酸色氨酸生物素44親和力10151015活性13～1515～18親合素（A）鏈霉親合素(SA)一、理化特性二、親合素/鏈霉親合素標(biāo)識標(biāo)識物：酶、膠體金異硫氰酸熒光素（FITC）HRP-AV(SA)過碘酸鈉、戊二醛ABC/SABC預(yù)制AV(SAV)-Biotin第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)一、敏捷度二、特異性三、穩(wěn)定性四、合用性五、其他第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及兩者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級放大作用等優(yōu)越性，使BAS及其有關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在多種標(biāo)識免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)識免疫檢測自動(dòng)化分析做出了極大的奉獻(xiàn)。一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理BAB法：

Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E

特點(diǎn)：以游離A分別連接B-Ab和B-EBA法Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特點(diǎn)：以A-E/SA-E替代BAB法中的A，省卻了加B-E的環(huán)節(jié)3.

ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特點(diǎn):將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC二、生物素-親合素系統(tǒng)