職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫體細(xì)胞克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)及影響因素職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫0106目錄0101020304克隆胚胎的構(gòu)建方法克隆胚胎的激活克隆胚胎的體外培養(yǎng)克隆胚胎的胚胎移植職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫01克隆胚胎的構(gòu)建方法職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫1.1供體（donor)細(xì)胞的獲得

供體細(xì)胞的獲得主要有2種途徑。一條途徑是直接從新鮮組織消化分離，不經(jīng)過體外培養(yǎng)直接用于體細(xì)胞克隆。多用于卵丘細(xì)胞等易于分離的細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)是操作迅速、簡(jiǎn)便，細(xì)胞不易發(fā)生遺傳變異；缺點(diǎn)是不能進(jìn)行細(xì)胞周期同期化和基因的改造。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫1.1供體（donor)細(xì)胞的獲得

另一條途徑是通過一定的方法建立體細(xì)胞的原代細(xì)胞系，經(jīng)過體外培養(yǎng)后用于體細(xì)胞克隆。此種方法多用在成纖維細(xì)胞等易于體外培養(yǎng)的細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)是在體外培養(yǎng)過程中，可以進(jìn)行基因改造并可以進(jìn)行細(xì)胞周期的同期化處理，還可以獲得很多遺傳背景相同的克隆動(dòng)物；缺點(diǎn)是體外培養(yǎng)可能影響克隆胚胎的重編程能力，從而影響克隆效率。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫1.2細(xì)胞周期同期化處理

體細(xì)胞克隆是兩個(gè)不同來源的細(xì)胞之間核質(zhì)的重新組合的過程，因此，核質(zhì)的協(xié)調(diào)是保證克隆效率的重要條件。細(xì)胞處于不同的細(xì)胞周期具有不同的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)蛋白組分。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫1.2細(xì)胞周期同期化處理用于細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞（核）有3大類：早期胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞（嚴(yán)格來講胚胎成纖維細(xì)胞也是體細(xì)胞）和體細(xì)胞，它們可來自活休或體外培養(yǎng)的細(xì)胞。移植前采用機(jī)械吹打或酶消化分散成單個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)、處理，使核供體細(xì)胞周期與受體細(xì)胞周期相協(xié)調(diào)和同步化，然后獲取細(xì)胞核（可含少量細(xì)胞質(zhì)）為供體。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫1.3

核移植（nucleartransplantation)

利用顯微操作技術(shù)將供體細(xì)胞移植到去核的卵母細(xì)胞并將細(xì)胞核融入到卵母細(xì)胞胞質(zhì)中是體細(xì)胞克隆中最為精細(xì)的一步。此操作通常需要借助顯微操作儀，對(duì)操作技能要求比較高。此操作通常有2種方法，即間接細(xì)胞融合法和直接注入法。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫1.3.1

間接細(xì)胞融合法

間接細(xì)胞融合法就是將供體細(xì)胞注射到卵周隙中，通過細(xì)胞融合使供體細(xì)胞核進(jìn)入到受體胞質(zhì)中。該技術(shù)發(fā)源于20世紀(jì)70年代，最初是使用滅活的仙臺(tái)病毒介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜的融合，而后逐漸被毒性較低的聚乙烯乙二醇代替。與化學(xué)誘導(dǎo)膜融合同時(shí)發(fā)展起來的電融合技術(shù)是目前最為常用的方法。電融合效率高，操作簡(jiǎn)便，但其受到的影響因素很多，如溫度、電脈沖參數(shù)、融合液的滲透壓、離子種類和濃度等。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫1.3.2

直接注入法

由于小鼠卵胞質(zhì)膜較脆、抗電擊能力差，而且小鼠體細(xì)胞較小，因此電融合率較低；再者，小鼠胚胎基因組激活發(fā)生在二細(xì)胞期，甚至在受精卵后期就開始表達(dá)，留給移入核的重編程時(shí)間短。因此Wakayama等利用Piezo驅(qū)動(dòng)的注射裝置，將小鼠的體細(xì)胞注射到卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重組胚胎，最終得到了克隆小鼠以及繼代連續(xù)克隆小鼠50多只。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫02克隆胚胎的激活職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫

克隆胚胎的激活是體細(xì)胞克隆技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。體細(xì)胞克隆胚胎的充分激活是保證胚胎正常發(fā)育的先決條件，只有在去核卵母細(xì)胞充分激活的情況下才可以指導(dǎo)移入的核發(fā)生重編程。目前對(duì)克隆胚胎的激活方法有電激活、化學(xué)激活和電刺激結(jié)合化學(xué)激活。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫2.1電激活

電刺激可產(chǎn)生顯著的跨膜Ca2+內(nèi)流。一般認(rèn)為短而高的直流電脈沖可導(dǎo)致真核生物質(zhì)膜脂雙層不穩(wěn)定。這種可逆的不穩(wěn)定使得質(zhì)膜瞬間產(chǎn)生小孔洞，便于細(xì)胞內(nèi)外離子和大分子的交換。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫2.1電激活

孔洞的大小受質(zhì)膜電位變化、脈沖時(shí)程、培養(yǎng)液離子強(qiáng)度以及細(xì)胞類型等多個(gè)因素影響。在細(xì)胞外Ca2+存在時(shí)，電穿孔可在多種動(dòng)物上誘導(dǎo)卵母細(xì)胞活化。如兔卵被刺激激活的效果取決于操作液中Ca2+的有無。這表明是Ca2+內(nèi)流而非電刺激本身具有直接的激活作用。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫2.1電激活

根據(jù)在核移植前或核移植后進(jìn)行激活而分為融合前激活、融合激活和融合后激活。

融合前激活，獲得的卵母細(xì)胞是萬能受體，即供體細(xì)胞不需要同期化，處于任何細(xì)胞周期的供體核移入該卵母細(xì)胞質(zhì)中都有發(fā)育為成活個(gè)體的潛能。首例體細(xì)胞克隆山羊就是通過這種方案取得成功的。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫2.1電激活

融合同時(shí)激活和融合后激活是最常采用的激活方法，尤其是融合后激活法，可以使供體核與卵胞質(zhì)充分的相互作用，有利于供體核的重編程。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫2.2化學(xué)激活

常用克隆胚胎的化學(xué)激活物質(zhì)有乙醇、離子霉素、鈣離子載體、放線菌酮和6-DMAP（6-二甲氨基嘌呤）。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫2.2化學(xué)激活

例如7%乙醇，把需激活的重組卵放入含7%乙醇的培養(yǎng)液中，在37℃、CO2培養(yǎng)箱中處理5min或室溫下處理7min,洗凈后進(jìn)行培養(yǎng)。離子霉素(ionomycin),使用濃度為5mol/L,處理時(shí)間為4～5min；6-DMAP，使用濃度為1.9～2mmol/L,處理時(shí)間為3～5h或更長。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫2.3電激活結(jié)合化學(xué)刺激

首先以電刺激激活重構(gòu)胚胎，然后再放入含放線菌酮的培養(yǎng)液滴培養(yǎng)一段時(shí)間，進(jìn)一步維持MPF（促成熟因子）活性處于低水平。為了減少重編程期間對(duì)供體核染色體的過度作用，放線菌酮的作用時(shí)間一般是3～5h,之后將克隆胚胎放入不含放線菌酮的相同培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫

克隆胚胎的激活是哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。上述的激活方案中最為常用的是電刺激誘導(dǎo)融合，在融合的同時(shí)往往就完成了激活，而且電激活法比較簡(jiǎn)單，容易操作。但化學(xué)激活的應(yīng)用使克隆的效率得到顯著提高。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫03克隆胚胎的體外培養(yǎng)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫

與正常交配獲得的胚胎相比，克隆胚胎染色體倍型的異常率高很多，核糖體RNA基因的活性以及許多蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)異常。體外培養(yǎng)系統(tǒng)的缺陷也是導(dǎo)致胚胎吸收、死亡、流產(chǎn)、死胎或出生后死亡以及巨胎癥的一個(gè)重要原因。

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體外培養(yǎng)主要是將克隆胚胎放到培養(yǎng)液內(nèi)，置于CO?培養(yǎng)箱中，在5%CO?、95%空氣（或5%CO?、88%N?、7%O?、100%濕度）及37～39℃進(jìn)行培養(yǎng)。使用的培養(yǎng)基有含血清或BSA(牛血清白蛋白)或者是無蛋白的化學(xué)限定培養(yǎng)基。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫04克隆胚胎的胚胎移植職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫

克隆胚胎在體外培養(yǎng)發(fā)育至一定階段就可以移植到同期發(fā)情處理過的代孕母體輸卵管或子宮內(nèi)進(jìn)行后期發(fā)育。目前在大家畜如牛上，非手術(shù)法移植技術(shù)已經(jīng)成熟，但對(duì)一些中小家畜如山羊、豬，目前多采用麻醉后