水體中抗生素原位采樣分析技術(shù)規(guī)程—薄膜擴(kuò)散梯度（DGT）法TechnicalRegulationsforInSituS—DiffusiveGradientsinThinFilms(DIT/LNEMA019—2024前言 II 12規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4方法原理 5材料及試劑 6儀器和設(shè)備 48水體中抗生素的測(cè)定步驟 9結(jié)果計(jì)算 10精密度和準(zhǔn)確度 8T/LNEMA019—2024本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省大連水文局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省環(huán)境監(jiān)測(cè)協(xié)會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省大連水文局、大連理工大學(xué)、大連市生態(tài)環(huán)境事務(wù)服務(wù)中心、大連計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院有限公司、遼寧省生態(tài)環(huán)境事務(wù)服務(wù)中心、遼寧省水資源管理和生態(tài)環(huán)保產(chǎn)業(yè)集團(tuán)、遼寧省生態(tài)環(huán)境廳、遼寧省生態(tài)環(huán)境保護(hù)科技中心、遼寧省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、遼寧省撫順?biāo)木?、遼寧省遼陽(yáng)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、蘇州科技大學(xué)等。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：孫大明、譚峰、趙輝、王主華、王丹陽(yáng)、馬芮、王陽(yáng)、李崇、劉首正、原暉、邸俊強(qiáng)、夏春龍、唐賀、趙璐璐、白玉花、汪琛棋、屈興勝、柴浩、徐明晗、郭一冰、趙云、董淑玲、楊瑞豐、武暕、張子伯、趙德君。1T/LNEMA019—2024水體中抗生素原位采樣分析技術(shù)規(guī)程—薄膜擴(kuò)散梯度（DGT）法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水體中抗生素含量的薄膜梯度擴(kuò)散（DGT）法測(cè)定流程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、海水、工業(yè)廢水和生活污水中的氟喹諾酮類(lèi)、磺胺增效劑甲氧芐基嘧啶以及磺胺類(lèi)抗生素的原位采樣分析。2規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)引用下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。HJ495-2009水質(zhì)采樣方案設(shè)計(jì)技術(shù)規(guī)定HJ494-2009水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)GB/T14581-1993水質(zhì)湖泊和水庫(kù)采樣技術(shù)指導(dǎo)GB3838-2002地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB5084-2021農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB8978-1996污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)GB5749-2022生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、GB3097-1997海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)HY/T147.1-2013海洋監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程第1部分：海水DB22/T2838-2017生活飲用水及水源水中10中抗生素的檢驗(yàn)方法超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法DB21/T3286-2020水質(zhì)5種磺胺類(lèi)抗生素的測(cè)定固相萃取高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法DB32/T3771-2020漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類(lèi)抗生素測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法DB37/T3738-2019水質(zhì)磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的測(cè)定固相萃取/液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法DB65/T3951-2016水質(zhì)多種藥物殘留量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)譜法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1抗生素antibiotics本標(biāo)準(zhǔn)中的抗生素主要指氟喹諾酮類(lèi)抗生素、磺胺類(lèi)抗生素以及磺胺增效劑甲氧芐基嘧啶等有機(jī)污染物。3.2原位測(cè)定insitumeasurement指在不擾動(dòng)樣本原有狀態(tài)的前提下，獲得關(guān)于其化學(xué)、物理、生物性質(zhì)的數(shù)據(jù)，保證待測(cè)物質(zhì)的形態(tài)和濃度不發(fā)生變化。3.3薄膜擴(kuò)散梯度diffusivegradientinthinfilms一種新型被動(dòng)采樣技術(shù)，標(biāo)準(zhǔn)的DGT裝置由結(jié)合相，擴(kuò)散相，濾膜以及固定這三層膜結(jié)構(gòu)的塑料外套組成。利用具有一定厚度的擴(kuò)散相凝膠將能夠與目標(biāo)物發(fā)生不可逆結(jié)合的結(jié)合相和待測(cè)環(huán)境隔開(kāi)，2T/LNEMA019—2024待測(cè)物擴(kuò)散通過(guò)擴(kuò)散相凝膠后被結(jié)合相吸附。在材料的有效吸附容量?jī)?nèi)，目標(biāo)物的富集量與富集時(shí)間有關(guān)，從而可以通過(guò)測(cè)定結(jié)合相上目標(biāo)物的質(zhì)量確定外界環(huán)境中待測(cè)目標(biāo)物的濃度。3.4DGT結(jié)合相DGTbindinggelDGT結(jié)合相是指DGT方法中用于吸附待測(cè)物的薄膜，組裝到DGT結(jié)構(gòu)的最內(nèi)層，常用的結(jié)合相材料為聚合物樹(shù)脂、商業(yè)SPE柱填料和新型吸附材料。3.5DGT擴(kuò)散相DGTdiffusivegelDGT的擴(kuò)散相是指為待測(cè)分子提供擴(kuò)散通道的薄膜，組裝在DGT結(jié)構(gòu)的中間層，是定量計(jì)算的基礎(chǔ)。常用的擴(kuò)散相材料有包括瓊脂糖交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠(APA)和瓊脂糖凝膠。3.6DGT濾膜filtermembraneDGT裝置的濾膜一般指內(nèi)部孔徑為0.45μm的濾膜，常用的DGT濾膜有聚偏氟乙烯膜(PVDF)、硝酸纖維素膜(CN)、醋酸纖維素膜和親水性聚醚砜濾膜(PES)。3.7擴(kuò)散系數(shù)diffusivecoefficient擴(kuò)散系數(shù)是指目標(biāo)離子在單位時(shí)間每單位濃度梯度的條件下、以擴(kuò)散的方式垂向通過(guò)單位面積擴(kuò)散相的質(zhì)量或摩爾數(shù)。它是一個(gè)衡量某種物質(zhì)分子通過(guò)隨機(jī)運(yùn)動(dòng)在另一種物質(zhì)中傳播速度的指標(biāo)。4方法原理DGT技術(shù)是以Fick第一擴(kuò)散定律為理論基礎(chǔ)，整個(gè)裝置由結(jié)合相、擴(kuò)散相和濾膜以及固定這三層膜的上下兩部分的塑料外套（AES樹(shù)脂）組成（圖1）。塑料蓋子可以卡在底座上，使底座、吸附膜、擴(kuò)散膜、濾膜無(wú)縫接觸，蓋子上有直徑為2cm的窗口，待測(cè)物質(zhì)通過(guò)窗口擴(kuò)散進(jìn)入內(nèi)部凝膠。圖1DGT裝置以及采樣原理圖其中，濾膜主要用來(lái)避免外界顆粒物進(jìn)入裝置內(nèi)部，擴(kuò)散相提供待測(cè)分子的擴(kuò)散通道，而結(jié)合相對(duì)待測(cè)物質(zhì)具有吸附作用，可以根據(jù)不同的分析物選擇不同的結(jié)合相材料。外部分析物通過(guò)濾膜以及擴(kuò)散相，最終固定在結(jié)合相上。通過(guò)測(cè)量結(jié)合相上吸附目標(biāo)物的質(zhì)量（M）可以實(shí)現(xiàn)對(duì)外界環(huán)境濃度（Cb）的定量。由于擴(kuò)散相的存在，使得在裝置表面擴(kuò)散紊流層占總體擴(kuò)散通路比率大大減小，在流動(dòng)良好的水體，紊流層厚度(δ)可以忽略不計(jì)。在靜態(tài)水中，也可以使用不同厚度的擴(kuò)散相裝置進(jìn)行準(zhǔn)確定量紊流層厚度。另外，參數(shù)擴(kuò)散系數(shù)是每個(gè)目標(biāo)物特有的參數(shù)，可以在實(shí)驗(yàn)室條件下單獨(dú)測(cè)定得到，此參數(shù)受實(shí)際環(huán)境條件影響很小，可以直接應(yīng)用于實(shí)際采樣過(guò)程中的計(jì)算，無(wú)需額外校正，相較于其他被動(dòng)采樣器，定量準(zhǔn)確性大大提高。3T/LNEMA019—2024此外，在DGT實(shí)際采樣過(guò)程中，復(fù)雜、多變的環(huán)境介質(zhì)往往會(huì)對(duì)結(jié)合相表面電荷狀況、目標(biāo)物的狀態(tài)等造成影響，但實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)pH在4~9的變化范圍內(nèi)、離子強(qiáng)度0.001~0.75mol/L的范圍內(nèi)、溶解性有機(jī)質(zhì)（DOM）介于0~20mg/L的范圍內(nèi)時(shí)，DGT裝置的采樣性能幾乎不受外界環(huán)境干擾。而在自然環(huán)境中，不同水體的pH、離子強(qiáng)度和溶解性有機(jī)質(zhì)（DOM）濃度普遍在5~8.5，0.01-0.5mol/L和1~20mg/L范圍內(nèi)，因此，實(shí)際采樣時(shí)復(fù)雜的外界環(huán)境條件DGT采樣的效果沒(méi)有明顯的影響。5材料及試劑所使用的試劑除了另有說(shuō)明外，均為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純，實(shí)驗(yàn)用水為新鮮制備的去離子水或蒸餾水。5.1材料DGT裝置、氮?dú)狻GT有機(jī)玻璃投放器、浮標(biāo)、手持式GPS儀、溫度計(jì)、塑封袋、10mL離心管等。5.2試劑5.2.1純水實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)為一級(jí)水、應(yīng)符合GB/T6682相關(guān)要求。5.2.2乙腈（CH3CN）液相色譜純。5.2.3甲醇（CH3OH）液相色譜純5.2.4抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，ρ=1000mg/L準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0mg抗生素標(biāo)準(zhǔn)樣品，用甲醇（5.2.3）溶解并定容到10mL的棕色容量瓶中，配制成1000mg/L抗生素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，制備的標(biāo)準(zhǔn)貯備液于－20℃以下冷凍、密封、避光保存，保存期5.2.5抗生素標(biāo)準(zhǔn)使用液，ρ=10.0mg/L取抗生素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（5.2.4）1.00mL于100.0mL容量瓶中，甲醇定容，混勻，配制成標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。于－20℃以下避光保存，保存期為90d。5.2.6抗生素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，ρ=100.0mg/L內(nèi)標(biāo)物推薦13C6-磺胺吡啶和環(huán)丙沙星-d8，也可使用其他性質(zhì)相近同位素物質(zhì)。用甲醇（5.2.3）作為溶劑配制，制備的標(biāo)準(zhǔn)貯備液于-20℃以下冷凍、密封、避光保存，保存期為180d。5.2.7抗生素內(nèi)標(biāo)使用液，ρ=1.0mg/L移取適量?jī)?nèi)標(biāo)貯備液（5.2.6用甲醇（5.2.3）稀釋?zhuān)?20℃以下避光保存，保存期為90d。6儀器和設(shè)備除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)A級(jí)玻璃量器。實(shí)驗(yàn)所涉及的玻璃器皿都經(jīng)過(guò)甲醇和超純水的徹底洗滌。4T/LNEMA019—20246.1液相色譜儀液相色譜儀：具紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。色譜柱：填料為5μmODS，柱長(zhǎng)25cm，內(nèi)徑4.6mm的反相色譜柱，或其它等效色譜柱。6.2高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：高效液相色譜具備梯度洗脫功能，質(zhì)譜儀配有電噴霧離子色譜柱：C18柱或其他等效色譜柱，柱長(zhǎng)50mm，內(nèi)徑2.1mm，填料粒徑1.7μm，或其他等效色譜柱。6.3微量進(jìn)樣器微量進(jìn)樣器：10μL、50μL和100μL。6.4濾膜濾膜：孔徑0.22μm醋酸纖維濾膜、親水性聚丙烯、親水性聚四氟乙烯（PTFE）或其他等效材質(zhì)。6.5分析實(shí)驗(yàn)室通用儀器設(shè)備一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。7DGT裝置的準(zhǔn)備（1）采用HLB-DGT裝置。該裝置結(jié)合相由通用型HLB填料摻雜于聚丙烯酰胺凝膠中制備而成，擴(kuò)散膜是瓊脂糖凝膠，厚度分別為0.5mm，0.8mm，1.0mm和1.4mm，濾膜是聚醚砜(PES)。（2）DGT裝置在室溫下保存，已開(kāi)封包裝的DGT裝置可放在裝有少量0.01MNaCl溶液的自封袋中，保持袋中濕潤(rùn)，并定期檢查。（3）為防止裝置受到污染，使用前勿使裝置長(zhǎng)時(shí)間暴露空氣中，勿用手或其他物品接觸DGT裝置暴露窗口。（4）裝置投放前，充氮?dú)?6h以上。8水體中抗生素的測(cè)定步驟8.1DGT裝置的投放8.1.1已采集的水樣采集的水樣裝到20L左右的容器中，將已準(zhǔn)備好的DGT裝置放置到容器中固定，保持裝置的采樣窗口朝向水體，并不斷攪動(dòng)水體（攪拌）。放置一段時(shí)間（60h）。8.1.2現(xiàn)場(chǎng)投放（1）將DGT裝置六個(gè)為一組固定在有機(jī)玻璃投放器上，然后將投放器放置到指定的采樣點(diǎn)沒(méi)入水中，用繩子固定。（2）在投放器的尼龍線末端系上浮標(biāo)，確定投放地點(diǎn)的位置，同時(shí)進(jìn)行GPS定位。記錄投放時(shí)間，測(cè)定水溫、水深、電導(dǎo)率、pH等常規(guī)參數(shù)。（3）DGT裝置在水體中一般持續(xù)放置7天。5T/LNEMA019—20248.2DGT裝置的回收和保存8.2.1已采集的水樣取出DGT裝置，用去離子水沖洗裝置的外表面，取出結(jié)合相后裝入自封袋內(nèi)，滴入幾滴去離子水保濕后，密封保存待分析。8.2.2現(xiàn)場(chǎng)回收通過(guò)GPS和浮標(biāo)找到DGT裝置位置，取出DGT裝置，用去離子水沖洗裝置的外表面，取出結(jié)合相后裝入自封袋內(nèi)，滴入幾滴去離子水保濕后，密封保存待分析。8.3DGT采集樣的分析8.3.1DGT結(jié)合相提取從DGT裝置中取出的固定相放到10mL離心管中，使用甲醇/乙酸(9:1v/v)混合溶劑5mL洗脫兩次的方式洗脫回收的DGT結(jié)合相，洗脫后取出固定膜，保存洗脫液待測(cè)定。8.3.2提取液的測(cè)定DGT洗脫液加入一定量?jī)?nèi)標(biāo)物，經(jīng)過(guò)氮吹濃縮至近干，復(fù)溶于1mLLC-MS/MS初始流動(dòng)相溶液中，過(guò)0.22μm的PES濾膜后，采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS/MS)測(cè)定抗生素。9結(jié)果計(jì)算9.1結(jié)合相上吸附痕量有機(jī)污染物質(zhì)量的計(jì)算吸附量（M,單位μg）的計(jì)算按照方程（1）進(jìn)行計(jì)算：Ce為提取液中目標(biāo)物的濃度，Ve為洗脫液體積，Vg為結(jié)合相體積，fe為目標(biāo)物的洗脫率。9.2DGT平均濃度（CDGT）的計(jì)算式中：?g為擴(kuò)散層厚度（cmD為痕量有機(jī)污染物在擴(kuò)散層中擴(kuò)散系數(shù)(cm2·s-1)，A為擴(kuò)散相的開(kāi)口的面積，t為DGT裝置的放置時(shí)間。9.3擴(kuò)散紊流邊界層（DBL）的計(jì)算DGT用于測(cè)定水中自由態(tài)離子的濃度存在擴(kuò)散邊界層δ,所以水體中應(yīng)用DGT時(shí)至少需要放置2種不同厚度擴(kuò)散膜組成的DGT裝置，從而可應(yīng)用下列公式得到兩個(gè)方程，其中δ和Cb為未知數(shù)，解方程得到δ的厚度和目標(biāo)物的濃度：6T/LNEMA019—2024（3）式中：M為單位時(shí)間內(nèi)的累積量，?g是擴(kuò)散膜厚度，As指有效采樣面積，t指DGT投放時(shí)間，Dg指擴(kuò)散膜的擴(kuò)散系數(shù)，Ag指DGT窗口暴露面積，Dw指水體擴(kuò)散系數(shù)。9.4方法檢出限本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限（MDL）測(cè)定步驟如下：1)儀器定量限（LOQLOQ是基于HPLC-MS/MS儀器十倍的信噪比S/N計(jì)算得出。2)方法檢出限（MDLMDL是將DGT裝置部署于空白溶液中采樣7天后測(cè)得的LOQ，代入公10精密度和準(zhǔn)確度10.1精密度的計(jì)算連續(xù)測(cè)量同一有證標(biāo)準(zhǔn)樣品6次，用式（4）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差Sn：X——n次測(cè)量的算術(shù)平均值；Sn——n次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差；相對(duì)偏差RSD用式（5）計(jì)算：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定3種濃度水平的平行樣品測(cè)試結(jié)果(≥6次）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于20%。10.2準(zhǔn)確度的計(jì)算準(zhǔn)確度通過(guò)測(cè)定加標(biāo)回收率來(lái)計(jì)算，選擇一個(gè)有證標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行加標(biāo)，重復(fù)測(cè)定6次，回收率按式（6）計(jì)算：（6）式中：?X%——加標(biāo)回收率；X——測(cè)定平均值；7T/LNEMA019—2024Xb——樣品本底值Xs——標(biāo)準(zhǔn)值。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定3種濃度水平的樣品加標(biāo)回收率測(cè)試結(jié)果，回收率應(yīng)在75%～120%之間。11廢物處理實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的廢物應(yīng)分類(lèi)收集，統(tǒng)一保管，并做好相應(yīng)標(biāo)識(shí)，委托有資質(zhì)的單位進(jìn)行處理。8T/LNEMA019—2024附錄A（規(guī)范性附錄）瓊脂糖擴(kuò)散膜在25℃下的擴(kuò)散系數(shù)本標(biāo)準(zhǔn)中DGT方法以瓊脂糖疊加PES濾膜作為擴(kuò)散層，抗生素在瓊脂糖擴(kuò)散相內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)通過(guò)擴(kuò)散室法進(jìn)行測(cè)定(圖1.1)，擴(kuò)散室包括A室和B室，兩室通過(guò)瓊脂糖擴(kuò)散相和聚醚砜濾膜相連，測(cè)定時(shí)，A室放置有裝有50mL含5mgL-1抗生素溶液(以0.01molL-1NaCl作為背景溶液)，B室僅放置0.