動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)石蠟組織切片的制備組織石蠟切片的制備WilliamOsler什么是病理學(xué)與病理技術(shù)病理學(xué)（Pathology）是研究疾病的病因、發(fā)病機(jī)制、病理變化結(jié)局與轉(zhuǎn)歸的醫(yī)學(xué)科學(xué)；幫助人類了解疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律,闡明疾病本質(zhì)；同時(shí)病理學(xué)科也是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的橋梁。病理技術(shù)是病理學(xué)的一個(gè)重要分支，是病理學(xué)研究中的方法學(xué)，是病理診斷的基礎(chǔ)。病理學(xué)乃醫(yī)學(xué)之本組織石蠟切片的制備一張制備良好的病理切片是病理學(xué)檢測(cè)、研究的重要工具與基礎(chǔ)。那如何制備病理切片呢？由于生物樣品各種組織成分不同，因此性質(zhì)也各異，如軟硬程度，疏松、致密程度，面積大小等都不相同，自然狀態(tài)下要將它們切成十幾微米甚至幾個(gè)微米的薄片，幾乎是辦不到的。組織石蠟切片的制備一張制備良好的病理切片是病理學(xué)檢測(cè)、研究的重要工具與基礎(chǔ)。那如何制備病理切片呢？包埋(embedding)就是將某些特殊的支持物質(zhì)浸入到組織塊內(nèi)部，利用支持物質(zhì)的物理特性，如由液態(tài)轉(zhuǎn)變成固態(tài)，使整個(gè)組織具有均勻一致的固態(tài)結(jié)構(gòu)和足夠的硬度，以利于用切片機(jī)制取極薄的切片。組織石蠟切片的制備石蠟切片技術(shù)冰凍切片技術(shù)將大塊的組織制成薄薄的切片，配合多項(xiàng)染色技術(shù)，用于后續(xù)檢測(cè)、診斷等組織石蠟切片的制備利用石蠟(paraffin)作為包埋劑，將浸過蠟的組織塊置于石蠟內(nèi)制成蠟塊，是組織學(xué)切片技術(shù)中最常用的一種包埋方法。石蠟切片能使組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值。組織石蠟切片的制備石蠟切片優(yōu)點(diǎn)：組織結(jié)構(gòu)保存良好，能切連續(xù)薄片。組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確?？砷L(zhǎng)期保存。缺點(diǎn)：制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多。解決方式：抗原熱修復(fù)---檸檬酸鹽緩沖液高溫煮30min(有效去除醛類固定劑導(dǎo)致的蛋白之間的交聯(lián)，充分暴漏石蠟切片等，樣品中的抗原表位，從而大大改善免疫染色效果)。組織石蠟切片的制備把固定后的組織或未經(jīng)固定的新鮮組織，不經(jīng)乙醇脫水、透明、浸蠟等一系列復(fù)雜的處理，直接液氮速凍變硬進(jìn)行切片。冰凍切片是以聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物（OCT）為包埋劑、以水作為支持物質(zhì)，包埋組織標(biāo)本和進(jìn)行切片。由于組織不經(jīng)有機(jī)溶劑的處理，不受浸蠟、包埋時(shí)高溫影響，所以能較好地保存各種酶、抗原的活性及脂肪、類脂的結(jié)構(gòu)。組織石蠟切片的制備冰凍切片的制作過程簡(jiǎn)單，一般只需幾十分鐘便可制成；在冰凍過程中，組織中水分易形成冰晶，往往影響抗原定位，同時(shí)冰凍切片比石蠟切片要厚，一般8-80μm，且清晰度較差；切片過程中易碎易爛，不能用于回顧性研究，切片標(biāo)本只能低溫短期保存。組織石蠟切片的制備遵循病理崗位工作流程對(duì)標(biāo)國(guó)家衛(wèi)生專業(yè)技術(shù)資格重點(diǎn)講解組織石蠟切片制備流程與注意事項(xiàng)組織石蠟切片的制備病理崗位工作流程取材與固定洗滌脫水透明包埋切片浸蠟對(duì)標(biāo)國(guó)家衛(wèi)生專業(yè)技術(shù)資格：病理學(xué)技術(shù)士

一、取材與固定思前想后組織在固定液中照片實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材照片復(fù)習(xí)組織取材操作注意事項(xiàng)；復(fù)習(xí)組織固定原理、常用固定液配方、固定流程與注意事項(xiàng)；檢查本組在上一任務(wù)中完成的組織固定情況，觀察有何變化并分享交流。二、洗滌固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會(huì)影響后期的染色效果多數(shù)用流水沖洗不同固定液應(yīng)選擇不同洗滌液或方法進(jìn)行洗滌三、脫水組織在固定液長(zhǎng)時(shí)間浸泡后，會(huì)含大量的水分，為了制片和長(zhǎng)時(shí)間保存，必須將水分置換成石蠟；為什么要對(duì)組織進(jìn)行脫水？水和石蠟互不相容，但水溶于乙醇，而乙醇和石蠟都可以溶于二甲苯，所以利用乙醇和二甲苯作為媒介，最終將組織中的水分替換成石蠟；組織突然進(jìn)入高濃度乙醇會(huì)發(fā)生收縮和變形，不利后續(xù)包埋、切片、染色，因此要從低濃度乙醇到高濃度乙醇中依次進(jìn)行。四、透明透明：脫水過程中，水分被乙醇取代，乙醇被石蠟的媒浸液取代，如二甲苯；而二甲苯與玻璃的折光率非常接近，采用光學(xué)顯微鏡觀察，感覺組織塊變得透亮，因此稱之為透明，同時(shí)二甲苯也稱為透明劑。透明劑的浸漬時(shí)間則要根據(jù)組織材料塊大小及屬于囊腔抑或?qū)嵸|(zhì)器官而定；如果透明時(shí)間過短，則透明不徹底，石蠟難于浸入組織；透明時(shí)間過長(zhǎng)，則組織硬化變脆，就不易切出完整切片，透明總時(shí)間不超過3h。五、浸蠟用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用，此過程為浸蠟過程。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時(shí)，五、浸蠟再先后移入2個(gè)熔化的石蠟液中浸漬3小時(shí)左右，浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)3℃左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。五、浸蠟用梯度濃度乙醇將組織內(nèi)水分置換出來二甲苯將組織內(nèi)乙醇置換出來（透明）用石蠟將組織內(nèi)二甲苯置換出來（浸蠟）透明浸蠟過程：組織脫水透明浸蠟包埋和切片五、浸蠟75%酒精4h85%酒精2h90%酒精2h95%酒精1h無水乙醇I30min無水乙醇II30min醇苯5-10min二甲苯I5-10min二甲苯II5-10min蠟I1h蠟II1h蠟III1h六、包埋包埋：是將某些特殊的支持物質(zhì)浸入到組織塊內(nèi)部，利用支持物質(zhì)的物理特性，將整個(gè)組織加以包埋，最后凝固成均勻一致的較硬固態(tài)結(jié)構(gòu)，以便切片機(jī)制備極薄切片。1.先將融化的蠟放入包埋框，設(shè)定包埋機(jī)參數(shù)；將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋；具體流程：2.取預(yù)熱包埋框及金屬板，搭成包埋模具；傾注少量熔蠟于包埋框中；從蠟杯中夾取組織塊，切面向下置于框底；加熔蠟至包埋框上緣，注意標(biāo)簽；3.于-20℃凍臺(tái)冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。六、包埋注意：1.準(zhǔn)備包埋蠟：一般應(yīng)用硬蠟（56~58℃或60~62℃）為好，所用的石蠟要求透明無雜質(zhì)，新的石蠟要反復(fù)熔凝，并有一定的粘韌性；蠟的熔點(diǎn)應(yīng)與組織的硬度相適應(yīng)；包埋用過的石蠟可以反復(fù)使用；六、包埋注意：2.包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于浸蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體；3.石蠟的迅速冷卻非常重要，否則包埋塊中將會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶。以后切片時(shí)引起碎裂。七、切片1.將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上；2.將切片刀固定在刀夾上，刀口向上；3.搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口；4.調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右；5.調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為4-10μm；七、切片6.一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時(shí)右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40-50r/min為宜；7.切成的蠟帶到20-30cm長(zhǎng)時(shí)，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上；七、切片8.用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好；9.切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下，擦去刀上沾著的石蠟，把切片機(jī)擦拭干凈妥為保存。七、切片切片是石蠟切片制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)易出現(xiàn)多種問題八、展片與貼片安裝切片刀片并做好防護(hù)；將蠟塊固定于切片機(jī)上，調(diào)整方向、角度、切片厚度等參數(shù)；再將一定長(zhǎng)度蠟帶（連續(xù)切片）或用刀片斷開成單個(gè)蠟片于溫水（45℃左右）中展平后，撈至涂有防脫