第3章

基因工程

我國(guó)是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。棉花在種植過(guò)程中，常常會(huì)受到一些害蟲(chóng)的侵襲，其中以棉鈴蟲(chóng)最為常見(jiàn)。棉鈴蟲(chóng)可以使棉花產(chǎn)量減少三分之一，嚴(yán)重時(shí)，甚至能使一片棉田絕收。大量施用農(nóng)藥殺蟲(chóng)不僅會(huì)提高生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境污染。要是能培育出自身就能抵抗蟲(chóng)害的棉花新品種，這一問(wèn)題就會(huì)迎刃而解，我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉就是在這樣的背景下產(chǎn)生的。(P67)棉花棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)

?1998年中棉所成功培育出我國(guó)第一個(gè)國(guó)審抗蟲(chóng)雜交棉新品種------中棉所29，使低齡棉鈴蟲(chóng)的死亡率超過(guò)90%；

?2002年成功培育出我國(guó)第一個(gè)雙價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種------中棉所41，該品種能夠緩解棉鈴蟲(chóng)抗藥性。

為什么傳統(tǒng)的雜交育種方法培育不出抗蟲(chóng)棉，基因工程卻可以？

是按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品，從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做重組DNA技術(shù)。生物體外1.操作環(huán)境：2.操作對(duì)象：3.操作水平：第3章

基因工程1.概念：P674.原理：5.結(jié)果：基因DNA分子水平基因重組按照人們的需要定向改造生物的遺傳特性1944年，艾弗里等人通過(guò)肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物個(gè)體間轉(zhuǎn)移。1958年，梅塞爾森和斯塔爾用實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制。幾乎同一時(shí)期確立的中心法則闡明了遺傳信息流動(dòng)的方向。1961年，尼倫伯格和馬太破譯了第一個(gè)編碼氨基酸的密碼子。截至1966年，64個(gè)密碼子均被破譯成功。1970年，科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制性?xún)?nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶）1950年，愛(ài)德曼發(fā)明了一種測(cè)定氨基酸序列的方法。2年后，桑格首次完成了對(duì)胰島素氨基酸序列的測(cè)定。1953年，沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假說(shuō)。1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。第3章

基因工程2.科技探索之路：基因工程的誕生和發(fā)展(P68-69)1972年，伯格首先在體外進(jìn)行了DNA的改造，成功構(gòu)建了第一個(gè)體外重組DNA分子。1977年，桑格等科學(xué)家發(fā)明了DNA序列分析的方法，為基因序列圖的繪制提供了可能。此后，DNA合成儀的問(wèn)世為體外合成DNA提供了方便。1982年，第一個(gè)基因工程藥物-重組人胰島素被批準(zhǔn)上市?；蚬こ趟幬锍蔀槭澜绺鲊?guó)研究和投資開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。1984年，我國(guó)科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)培育出世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚(yú)。1973年，科學(xué)家證明了質(zhì)?？梢宰鳛榛蚬こ痰妮d體，并實(shí)現(xiàn)了物種間的基因交流。至此，基因工程正式問(wèn)世。1983年，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。此后，基因工程進(jìn)入了迅速發(fā)展的階段。2013年，華人科學(xué)家張鋒及其團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道利用最新的基因組編輯技術(shù)---CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)）技術(shù)編輯了哺乳動(dòng)物基因組。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。1985年，穆里斯等人發(fā)明PCR，為獲取目的基因提供了有效手段。第3章

基因工程2.科技探索之路：基因工程的誕生和發(fā)展(P68-69)1990年，人類(lèi)基因組計(jì)劃啟動(dòng)。2003年，該計(jì)劃的測(cè)序任務(wù)順利完成。21世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)家發(fā)明了多種高通量測(cè)序技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)低成本測(cè)定大量核酸序列，加速了人們對(duì)基因組序列的了解。課堂練習(xí)基于基因工程的誕生和發(fā)展的相關(guān)基礎(chǔ)理論，判斷下列說(shuō)法的正誤。1.1953年，沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并用實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制。（

）2.1970年，在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制酶，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)了多種限制酶、DNA連接酶等。（

）3.1972年，伯格首先在體外進(jìn)行了DNA的改造，并構(gòu)建了第一個(gè)體外重組DNA分子。（

）4.1983年，科學(xué)家采用花粉管通道法培育了世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。（

）5.1984年，我國(guó)科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)培育了世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚(yú)。（

）×√√×√3.1

重組DNA技術(shù)的基本工具從社會(huì)中來(lái)

番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵害。當(dāng)番木瓜受到這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降?？茖W(xué)家通過(guò)精心設(shè)計(jì)用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專(zhuān)門(mén)的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？非轉(zhuǎn)基因番木瓜（右）轉(zhuǎn)基因番木瓜(左）實(shí)現(xiàn)這一精準(zhǔn)的操作過(guò)程，至少需要三種“分子工具”，即準(zhǔn)確切割DNA的“分子手術(shù)刀”、將DNA片段再連接起來(lái)的“分子縫合針”和將體外組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的“分子運(yùn)輸車(chē)”。重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具”一、限制性?xún)?nèi)切核酸酶二、DNA連接酶三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體一、限制性?xún)?nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”:P711.來(lái)源：2.作用：主要是從原核生物中分離純化來(lái)的能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。注意作用部位：磷酸二酯鍵3.結(jié)果：黏性末端和平末端（酶專(zhuān)一性）資料卡限制酶名字的由來(lái)：P72

限制酶是如何命名的呢？是用生物屬名的頭一個(gè)字母與種加詞的頭兩個(gè)字母，組成了3個(gè)字母的略語(yǔ)，以此來(lái)表示這個(gè)酶是從哪種生物中分離出來(lái)的.例如，一種限制酶是從大腸桿菌(Escherichiacoli）的R型菌株分離來(lái)的，就用字母EcoR表示;如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來(lái)的第一種限制酶,則進(jìn)一步表示成EcoRI。例如，流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ二、拓展應(yīng)用1.想一想，為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？

細(xì)菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因?yàn)楹心撤N限制酶的細(xì)胞的DNA分子，不具備這種限制酶的識(shí)別序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。所以，盡管細(xì)菌中含有限制酶，但它自身的DNA也不會(huì)被切割，并且可以防止外源DNA入侵。思考：如何將切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA分子？練習(xí)與應(yīng)用：P74P72靠DNA連接酶來(lái)完成的。種類(lèi)______________________________________來(lái)源大腸桿菌T4噬菌體作用差別

連接____________和____________

E·coliDNA連接酶T4DDNA連接酶黏性末端平末端

二、DNA連接酶——“分子縫合針”：P72都能將雙鏈DNA片段“縫合“起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵。（注意：E·coliDNA連接酶連接平末端的效率較低）思考：P72DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？不是一回事。雖然兩者都是催化磷酸二酯鍵形成的酶，化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)，但兩者存在顯著的區(qū)別：區(qū)別DNA連接酶DNA聚合酶不同點(diǎn)模板不需要模板需要DNA的一條鏈作模板作用對(duì)象催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵只能催化單個(gè)核苷酸加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵作用結(jié)果形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈用途基因工程DNA復(fù)制根據(jù)所學(xué)知識(shí)，據(jù)圖完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶ba1.切斷a處的酶為_(kāi)______

2.連接a處的酶為_(kāi)______3.切斷b處的酶為_(kāi)______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵反饋練習(xí)練習(xí)與應(yīng)用：P74C三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”：P721.常用載體：質(zhì)粒（1）本質(zhì)：（2）特點(diǎn)：是一種裸露、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段（基因）插入其中。攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。注意：在基因工程中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。這些質(zhì)粒上常有特殊的標(biāo)記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重組DNA分子的篩選。小結(jié)：質(zhì)粒適于做載體的特點(diǎn)（學(xué)生朗讀）（1）.有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段插入；（2）.攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制；（3）.人工改造的質(zhì)粒常帶有特殊的標(biāo)記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重組DNA分子的篩選。2.其他載體：P72-73除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動(dòng)植物病毒等?？偨Y(jié)：重組DNA技術(shù)的基本工具有限制酶、DNA連接酶和載體；

工具酶:只有限制酶和DNA連接酶。練習(xí)與應(yīng)用：P74A課堂小結(jié)：3.1重組DNA技術(shù)的基本工具一、限制性?xún)?nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”1.來(lái)源：原核生物(主要)2.作用：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。（體現(xiàn)酶具有專(zhuān)一性的特點(diǎn)）3.結(jié)果：黏性末端和平末端二、DNA連接酶——“分子縫合針”E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”1.常用載體：質(zhì)粒（本質(zhì)、特點(diǎn)）2.其他載體：噬菌體、動(dòng)植物病毒等

高考真題（2024·湖南·高考真題）某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶酶切時(shí)，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒(méi)有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．限制酶失活，更換新的限制酶B．酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等C．質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識(shí)別位點(diǎn)缺失，更換正常質(zhì)粒DNAD．酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，換用對(duì)DNA甲基化不敏感的限制酶B酶切條件不合適通常會(huì)使切割效果下降，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和PH等，調(diào)整酶的用量沒(méi)有作用，B錯(cuò)誤。

探究.實(shí)踐

DNA的粗提取與鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理:P74基本思路：DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行提取。1.DNA的提?。篋NA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可以用酒精初步分離DNA與蛋白質(zhì)。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。2.DNA的鑒定：DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。DNA+二苯胺沸水浴加熱藍(lán)色二、目的要求:P741.了解DNA的物理和化學(xué)性質(zhì)，理解DNA粗提取和鑒定的原理。2.學(xué)會(huì)DNA粗提取的方法以及用二苯胺試劑對(duì)DNA進(jìn)行鑒定。三、材料用具：P741.材料洋蔥菜花香蕉豬肝菠菜2.用具:略

探究.實(shí)踐

DNA的粗提取與鑒定三、方法步驟:P74-75（學(xué)生朗讀）1.研磨洋蔥：稱(chēng)取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，切碎，倒入10mL研磨液，充分研磨。2.過(guò)濾獲取含DNA的上清液：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過(guò)濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。3.冷卻酒精析出DNA：在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或者將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。研磨洋蔥

探究.實(shí)踐

DNA的粗提取與鑒定三、方法步驟:P74-754.DNA的鑒定：取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。

探究.實(shí)踐

DNA的粗提取與鑒定注意事項(xiàng)：1.在將待鑒定的提取物加入2mol/L的NaCl溶液中溶解時(shí)，需要不斷攪拌以增加溶解的DNA的量，建議攪拌3min以上。2.二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證實(shí)驗(yàn)效果。加入二苯胺試劑后沸水浴處理的時(shí)間要在5min以上，且要等到冷卻后再觀察結(jié)果，這樣才可以觀察到較為明顯的顯色反應(yīng)。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：P751.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可含有哪些雜質(zhì)嗎？（1）觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多。（2）二苯胺試劑鑒定呈藍(lán)色說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能原因有：所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程出現(xiàn)了失誤等?？赡芎泻说鞍住⒍嗵堑入s質(zhì)。

探究.實(shí)踐

DNA的粗提取與鑒定四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：P753.與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。

同學(xué)們可采取分組的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？梢赃x取不同的實(shí)驗(yàn)材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對(duì)同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種方法提取效果更好。五、進(jìn)一步探究：P75

本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)DNA進(jìn)行了粗提取，請(qǐng)查閱資料，了解實(shí)驗(yàn)室提取純度較高的DNA的一種方法，并與本實(shí)驗(yàn)中所使用的方法進(jìn)行比較，總結(jié)兩種方法的異同。

探究.實(shí)踐

DNA的粗提取與鑒定探究.實(shí)踐

DNA的粗提取與鑒定P74四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)3與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。同學(xué)們可采取分組的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。可以選取不同的實(shí)驗(yàn)材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對(duì)同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試