-14-茶樹菇廢料對滑菇漆霉活性變化規(guī)律的影響1引言1.1滑菇漆酶測定滑菇作為一種白腐真菌十幾年前就被證明可以產(chǎn)生漆酶。而漆酶（Laccase,苯二醇氧化還原酶），因為對多種有毒性物質(zhì)的分解降解均有作用，所以漆酶能夠降解木質(zhì)素，這使漆酶在廢水處理和生物漂白等方面發(fā)揮著重要的作用[4]。漆酶在工業(yè)上可用于除去廢水毒性，最近幾年來，在制造除草劑、飲料飲品加工、環(huán)境保護(hù)、造紙等各個方面也都得到了廣泛的研究和應(yīng)用。漆酶是一種含有銅離子的活性蛋白質(zhì)，通過3種銅離子的協(xié)同傳遞電子以及變化價態(tài)的過程來實現(xiàn)對酚及其衍生物、羧酸及其衍生物、芳胺等物質(zhì)的催化氧化作用，且漆酶的活性中心含有4個3種不同的銅離子，因此起到對毒物的降解和對環(huán)境的保護(hù)。而香菇已經(jīng)被證實可產(chǎn)生活性很強(qiáng)的漆酶，因為其具有價格低、易于栽、培產(chǎn)量大等特點。1.2漆酶：漆酶是一種含Cu2+的多酚氧化酶[1]，能催化酚類等6大類約250多種不同類型底物的氧化反應(yīng)[2]，是一類性質(zhì)相近而又不完全相同的多酚氧化酶的總稱，不同來源的漆酶其氧化能力和反應(yīng)性能有較大的差異[3]。由于漆酶具有特殊的催化性能和廣泛的作用底物，所以其在木質(zhì)素降解[4]、染料脫色[5]、綠色有機(jī)物質(zhì)的合成[6]、紙漿漂白[7]、含酚廢水檢測及處[8]、生物燃料電池的陰極反應(yīng)[9]、食品飲料中酚類物質(zhì)的去除[10]。研究還發(fā)現(xiàn)很多食用菌菌體中富含漆酶，它有利于呼吸過程中電子傳遞的正常運(yùn)行，呼吸過程正常運(yùn)轉(zhuǎn)，為菌體的生命活動提供充足的可利用的能量，從而加速菌體的生長發(fā)育[11]。此外，在菌絲體生長發(fā)育過程中，漆酶在分解木質(zhì)素的同時還會產(chǎn)生酚類或醌類化合物，而酚類或醌類物質(zhì)是有毒物質(zhì)，是1種很好的殺蟲劑，能夠抑制雜菌的生長，從而防止雜菌進(jìn)一步污染，并影響菇類菌體的生長發(fā)育[12]。由此可見，漆酶參與真菌體內(nèi)的許多生物化學(xué)反應(yīng)，具有重要的生理功能[13]，影響著真菌的發(fā)育及形態(tài)的發(fā)生[14]。如何縮短食用菌生產(chǎn)周期及提高抗雜菌能力、降低成本，是為了針對目前有些珍貴食用菌生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)成本高的實際情況，成為目前食用菌育種亟待解決的關(guān)鍵問題之一，這也體現(xiàn)了食用菌在不同條件下菌絲產(chǎn)漆酶規(guī)律的相關(guān)性研究甚少。等方面具有廣泛的應(yīng)用潛力。漆酶可存活于空氣中，不過漆酶普遍的存在菇、菌及植物中，本質(zhì)上是一種環(huán)保型酵素，其反應(yīng)后唯一的產(chǎn)物就是H2O。作為高效的生物檢測器，漆酶獨特的催化特性使其在生物檢測中有廣泛的應(yīng)用，可以成為底物、輔酶、抑制劑等成分分析的有漆酶的測定方法較多，其中本次的實驗采用的是分光光度法，因為它的實驗條件要求低、并且還易于操作和靈敏度高等，其他方法還有比如高壓液相色譜法、氧吸收法、極譜法及脈沖激光光聲光譜法等。測定活性利用的可用底物還有鄰苯二酚、2，6-甲氧基酚等，這次選擇的底物是ABTS（2，2-聯(lián)氮-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）。本實驗通過探究香菇培養(yǎng)基微堿化對漆酶活性的影響，從而得出不同的PH值對產(chǎn)生的漆酶活的性不同，同時對于香菇產(chǎn)漆酶的量以及活性強(qiáng)度提供一些的理論依據(jù)。2材料與方法2.1.1原料玉米粉、酵母膏、蔗糖均購于市場。磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、維生素B1由寧德師范學(xué)院生物實驗中心食用菌研究室提供。茶樹菇廢料由古田食用菌基地提供滑菇菌種引進(jìn)單位為三明真菌研究所接種日期為2018年12月，由寧德師范學(xué)院生物實驗中心食用菌研究室保藏。2.1.2儀器設(shè)備水浴鍋、MC電子天平（YP802N）、超聲細(xì)胞粉碎機(jī)、電磁爐、高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z型）、鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A）、超凈工作臺（SW--CJ--2D型）、搖床、離心機(jī)（TGL-15B）、紫外可見分光度計（T6新世紀(jì)）、酒精燈、培養(yǎng)皿、打孔器、接種鉤、燒杯、玻璃棒、25*200試管、30ml離心管、錐形瓶等。2.1.3藥品瓊脂粉；葡萄糖粉(購于福州貝爾曼公司)；氫氧化鈉；磷酸二氫鉀(購于福州貝爾曼公司)；七水硫酸鎂；ABTS;98%乙醇；蛋白胨(購于福州貝爾曼公司)；酵母膏(購于福州貝爾曼公司)；維生素B1(購于福州貝爾曼公司);醋酸-醋酸鈉緩沖液(寧德師范學(xué)院生物實驗中心食用菌研究室提供）；試劑及其配置表2-1-3試劑配置方法表試劑名稱試劑濃度配置方法準(zhǔn)確稱取0.137gＡＢＴＳ，ABTS緩沖液0.25mol/L用０.１ｍｏｌ／Ｌ醋酸－醋酸鈉緩沖溶液定容到１Ｌ準(zhǔn)確稱取3.86克冰醋酸和醋酸－醋酸鈉緩沖溶液0.1mol/L2.93克醋酸鈉加入到接近1升的蒸餾水水中,充分?jǐn)嚢?定容至1升2.2方法2.2.1菌種的活化以及擴(kuò)種①制備1000ml的PDA培養(yǎng)基，用高壓滅菌鍋（121攝氏度20min）將滅菌工具放在干燥箱（60攝氏度3小時）中烘干后放入超凈工作臺和并將滅菌后的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行倒皿冷卻備用；②將保存于4℃冰箱中的滑菇食用菌的試管母種進(jìn)行活化，菌種取出放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中或者放在室內(nèi)常溫活化24—48h,活化結(jié)束后將菌種轉(zhuǎn)接到PDA試管培養(yǎng)基上。③25℃恒溫培養(yǎng)10--12天，待菌絲將要長滿培養(yǎng)皿后，取后將剩余部分放入4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?，同時將未置于冰箱的PDA試管培養(yǎng)基利用打孔器和鑷子轉(zhuǎn)接到固化培養(yǎng)基上，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10—15天（具體天數(shù)依據(jù)菌絲長滿培養(yǎng)基表面為準(zhǔn)），放入冰箱備用。2.2.2培養(yǎng)基的配制本次實驗設(shè)計一個培養(yǎng)基配方[15]：標(biāo)準(zhǔn)液體培養(yǎng)基（玉米粉30g、蔗糖20g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、廢料0g）培養(yǎng)基的制作：液體培養(yǎng)基的制作：①稱量（1）廢料0g、酵母膏3g、維生素B10.05g、七水硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀1g、蔗糖20g、玉米粉30g；（2）廢料10g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖16g、玉米粉24g；（3）廢料20g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖12g、玉米粉18g；（4）廢料30g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖8g、玉米粉12g；（5）廢料40g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖4g、玉米粉6g；（6）廢料50g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖0g、玉米粉0g；②用1000ml燒杯，先加入500ml的自來水，再加入將上述稱取的相應(yīng)藥品，攪拌均勻后倒入1000ml的量筒定容；③取干燥潔凈的500ml錐形瓶分裝發(fā)酵液，在瓶口包上封口膜與報紙和包好的打孔器（5mm）、鑷子等接種器具進(jìn)行高壓滅菌，在121℃下滅菌20min后，將接種器具放入60℃的烘干箱烘3h。④接種，待發(fā)酵液冷卻后，與接種器具一起放入超凈工作臺進(jìn)行紫外燈滅菌30min,接入上述平板菌種，每瓶接入5個5mm的菌球；⑤培養(yǎng)，在28℃150r/min的搖床里搖床培養(yǎng)16d后備用；2.2.3滅菌液體培養(yǎng)基的滅菌準(zhǔn)備好500ml的錐形瓶，將上述的液體培養(yǎng)基分別裝入，并貼好標(biāo)簽，和包好的打孔器、鑷子和離心管等接一起放入高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行121℃高壓滅菌，滅菌20min左右。取出，接種器和離心管放入烘干機(jī)60℃烘干。2.2.4接種及培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的接種將已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的液體培養(yǎng)基分別倒入250ml的錐形瓶中，然后和接種儀器置于超凈工作臺，紫外燈照消毒30min,然后用滑菇菌種對不同廢料比例的培養(yǎng)基進(jìn)行接種，用內(nèi)直徑為4mm的無菌打孔器，接種量為5個，將接完種的錐形瓶移入搖床中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，在28℃150r/min的搖床里搖床培養(yǎng)，2-16d左右進(jìn)行酶活性檢測。2.2.5粗酶液的提取液體培養(yǎng)基粗酶液的提取：用四層紗布包扎，對粗酶液經(jīng)過過濾處理后，使用規(guī)格為4000r/min離心機(jī)進(jìn)行離心10min后取其上清液，即為粗酶液?？捎美洳叵浔４?zhèn)溆谩?.2.6酶活力的測定液體培養(yǎng)基的酶活力測定（1）ABTS溶液配制：用0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液將0.137g的ABTS定容至1L，配制成濃度為0.25mol/LABTS緩沖液。（2）將搖床培養(yǎng)2-16d左右的培養(yǎng)液利用過濾網(wǎng)過濾后得到濾液，再取濾液30ml于離心管中；（3）將離心管進(jìn)行4000r/min離心,離心后放于4℃的冰箱中備用ABTS測定酶活：采用ABTS法，分別移取1ml粗酶液置于兩只試管中，設(shè)立對照組，將作為對照的其中一只試管煮沸5min，作向兩只試管中分別加入2mlABTS（濃度為0.25mmol/L）緩沖液放于40℃水浴鍋中進(jìn)行水浴，水浴時間為3分鐘，水浴結(jié)束后取出后在410nm波長處測吸光度。一個酶活力單位用每分鐘吸光度增加0.1為一個酶活力單位。式中：V1為反應(yīng)總體積/mL；V2為測定酶活力時所取的酶液體積/mL；N為酶液稀釋倍數(shù)；Δt為反應(yīng)時間的變化量；ε為3.6×104/(mol/(L?cm))；ΔA為吸光度的增量。3實驗結(jié)果與分析3.1液體培養(yǎng)基茶樹菇廢料比例對漆酶活性的影響菌絲培養(yǎng)2d后到設(shè)計的取樣點，培養(yǎng)2—16d，每隔2d取樣檢測表3-2-1Day2配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)30.050.010%13.35512.0212.0212.47±0.885abA20%16.02613.35512.0213.8±2.226aA40%12.024.0112.029.35±5.34abcAB60%10.68410.6842.678.01±5.34bcAB80%6.6774.012.674.45±2.227cdBC100%01.3400.45±0.89dC表3-2-2Day4配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3單位（U/L）0.050.010%380.609364.583212.34319.18±92.87abAB20%563.568455.395401.976473.65±82.33aA40%156.25328.526312.5265.76±95.18bABC60%397.97130.876130.876219.91±154.21bcBCD80%45.40674.78696.15472.12±25.48cdCD100%030.71616.02615.58±15.36dD表3-2-3Day6配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3單位（U/L）0.050.010%1017.6281069.712993.591026.98±38.91aA20%1100.4271065.7051136.4851100.87±35.39aA40%777.244572.917682.425677.53±102.25bB60%572.9166667711.806638.355641.03±69.48bB80%297.81156.25344.551266.2±98.05cC100%74.78638.729104.16772.56±32.78dD表3-2-4Day8配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3單位（U/L）0.050.010%1901.7091772.1691718.751797.54±94.08bAB20%2049.9472139.4232106.0362098.47±45.22aA40%1406.251477.031860.311581.2±244.3bBC60%1237.9811335.471235.311269.59±57.07cC80%1069.712830.662771.902890.76±157.74dD100%136.218348.558132.212205.66±123.77eE表3-2-5Day10配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3單位（U/L）0.050.010%2180.8232353.0982114.0492215.99±123.34bB20%2697.652649.5732800.4812715.9±77.09aA40%2048.6112202.191681.3571977.39±267.62bcBC60%1621.2611778.8461956.4641785.52±167.7cC80%1366.1861284.7221266.0261305.64±53.26dD100%311.165439.37244.391331.64±99.09eE表3-2-6Day12配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3單位（U/L）0.050.010%1945.781760.151741.4531815.79±112.96bB20%2067.3082122.0622122.0622103.81±31.61aA40%1427.6181514.4231469.0171470.35±43.42cC60%1291.341371.5281179.221280.7±96.59dC80%1067.041977.564892.094978.9±87.48eD100%391.293393.964169.605318.29±128.77fE表3-2-7Day14配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3單位（U/L）0.050.010%1316.7741172.5431499.7331329.68±163.98aA20%1378.2051485.0431339.4761400.91±75.39aA40%1140.4911080.3951033.6541084.85±53.56bB60%1005.609897.436981.571961.54±56.8bcBC80%968.216797.276805.289856.93±96.46cC100%174.947172.276129.541158.92±25.48dD表3-2-8Day16配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3單位（U/L）0.050.010%1018.964830.6621088.408979.34±133.36abAB20%1111.1111021.6351278.0451136.93±130.14aA40%862.714813.301759.882811.97±51.43bcBC60%962.874685.096836.004827.99±139.06bcBC80%789.263564.904699.786684.65±112.94cC100%134.882110.84482.799109.51±26.07dD從表3-2-1至表3-2-8可以看出，廢料濃度20%的漆酶活力均值最高，其中當(dāng)菌絲生長到第10天時酶活力峰值達(dá)到最高2715.9±77.09U/L?；揭后w培養(yǎng)基在廢料濃度20%時漆酶活性最強(qiáng)，培育基的廢料比例能夠影響漆酶的活力值大小。實驗表明：滑菇液體培養(yǎng)基廢料比例的不同對滑菇菌絲漆酶活性有影響，在廢料比例為20%時漆酶活力最大，所以廢料比例20%時對菌絲漆酶活性的促進(jìn)作用最強(qiáng)。圖3.1.1液體培養(yǎng)基不同茶樹菇廢料濃度滑菇的漆酶活力值從圖3.1.1中可以看出滑菇液體培養(yǎng)基在不同的廢料比例中，滑菇漆酶活性隨著廢料比例的上升呈先上升后下降的鐘罩型，在時間2-16天的測試中都在第10天的菌絲酶活性達(dá)到最強(qiáng)。對比廢料比例不同的漆酶酶活性的大小和變化，可以看出隨著廢料比例的上升，漆酶活力值先上升再下降，廢料比例為20%時滑菇有較高的分泌漆酶的能力。圖3.1.1液體培養(yǎng)基不同日期滑菇的漆酶活力值4結(jié)論與討論液體培養(yǎng)基從菌絲的生長速度方面而言菌絲球差異較大，且廢料比例為20%時，液體培養(yǎng)基的滑菇菌絲球的生長速度最快。經(jīng)ABTS法檢測菌絲漆酶活性，廢料比例為100%時菌絲的吸光值最小，即漆酶活性最弱；廢料比例為20%時菌絲的吸光值最大，即漆酶活性最強(qiáng)。計算后發(fā)現(xiàn)酶活力在0%、20%、40%、60%、80%、100%時差異顯著。因此，為提高漆酶活性，可使用20%的茶樹菇廢料進(jìn)行培養(yǎng)。生產(chǎn)培養(yǎng)基從菌絲的生長速度方面而言菌絲生長差異較大，且廢料比例為20%時，生產(chǎn)培養(yǎng)基的滑菇菌絲球的生長速度均很快。經(jīng)ABTS法檢測菌絲漆酶活性，從表3-1-4可以看出加廢料比例在80%時菌絲的吸光值最小，即漆酶活性最弱；廢料比例在20%時菌絲的吸光值均較大，即漆酶活性相對較強(qiáng)。計算后發(fā)現(xiàn)酶活力在0%、20%、40%、60%、80%、100%時差異顯著。因此，為提高漆酶活性，可使用20%的茶樹菇廢料進(jìn)行培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[1]凌慶枝,董麗輝,高麗麗,等.亮菌漆酶的初步研究[J].食品科學(xué),2009,30(19):190-193.[2]BourbonnaisR,PaiceMG,FreiermuthB,etal.ReactivitiesofvariousmediatorsandlaccaseswithKraftpulpandligninmodelcompounds[J].ApplEnviron,Microbiol,1997,63:4627-4632.[3]胡平平,付時雨.漆酶催化活性中心結(jié)構(gòu)及其特性研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2001,21(3):69-75[4]SREBOTNIKE,HAMMELKF.Degradationofnonphenolicligninbythelassace/1-hydroxy-benzotriazolesystem[J].JournalofBiotechnology,2002,81(2/3):179-188.[5]高恩麗,張數(shù)江,夏黎明.云芝菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶及其對靛藍(lán)脫色的研究[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報,2007,21(1):111-115.[6]KARASMYSHEVAV,SHLEEVSV,KOROLEVAOV,etal.Laccasecatclyzedsynthesisofconductingpolyaniline[J].EnzymeMicrobTechnol,2003,33(5):556-564.[7]CALLHP,MüCKEI.Historyofoverviewandapplicationsofmediatedlignolyticsystems,especiallyhccase-mediator-systems(Ligonzym?-process)[J].JBiotechnol,1997,53(2/3):163-202.[8]GomesSASS，NogueiraJMF，ＲebeloMJF．Anamperometricbiosensorforpolyphenoliccompoundsinredwine［J］．BiosensorsandBioelectronics，2004，20(6):1211－1216．[9]FabioV，AntonioC，SantaＲ，etal．Ahighsensitivityamperometricbiosensorusingamonomolecularlayeroflaccaseasbiorecognitionelement［J］．BiosensorsandBioelectronics，2004，20(2):315－321．[10]KatzE，F(xiàn)ilanovskyB，WillnerI．Abiofuelcellbasedontwoimmisciblesolventsandglucoseoxidaseandmicroperoxidasemonolayerfunctionlizedelectrodes［J］．NewJChem，1999(23):481－487．[11]ServiliM，DeStefanoG，PiacquadioP，etal．Anovelmethodforremovingphenolsfromgrapemust［J］．AmJEnolViticulture，2000(51):357-361[12]TurnerEM，WrightM，WardT，etal．Productionofethyleneandothervolatilesandchangesincellulaseandlaccaseactivitiesduringthelifecycleofthecultivatedmushroom，Agaricusbisporus［J］．GenMicrobiol，1975，91(1):167－176．BollagJM，ShuttleworthKL，AndersonDH．Laccase－mediateddetoxificationofphenoliccompounds［J］．ApplEnvironMicrobiol，1988，54(12):3086－3091．[14]BourbonnaisＲ，PaiceMG．Oxidationofnonphenolicsubstrates:Anexpandedroleforlaccaseinligninbiodegradation［J］.FebsLetters，1990，267(1):99－102．[15]熊艷車振明呂磊爪哇香菇液體種子培養(yǎng)基的優(yōu)化《食品工業(yè)科技》2008,(05):138-140致謝大學(xué)四年的時光匆匆流逝，回想四年間的每一段回憶，心里滿滿的都是感激之情。無論是濃厚的師生之情、難為的同窗友誼都在我心中深深的刻下，在此我想向那些關(guān)心我的、照顧我的、疼愛我的每一位恩師、同學(xué)、家人和朋友表示崇高的尊敬和由衷的感謝。首先需要感謝學(xué)校，給了我寶貴的大學(xué)四年的學(xué)習(xí)時光；其次需要感謝學(xué)院，接納和培養(yǎng)著我；而后想要感謝我的恩老——張維瑞老師，在最開始愿意跨專業(yè)的收我，不厭其煩一次又一次的教我之前沒有接觸過實驗里的東西，在論文指導(dǎo)也是從選題到思路到構(gòu)造巨細(xì)無遺的講解，更是在生活、工作、學(xué)習(xí)中給了我許多的鼓勵和支持，他為人師表的職業(yè)品德讓我感受到一位優(yōu)秀教師的感染力和影響力。借此機(jī)會我要向張維瑞老師表達(dá)最崇高的尊敬和最由衷的感謝。這次大學(xué)時光的結(jié)束，不是我的終點，而是新的起點。學(xué)習(xí)也不是就走到了盡頭，而是開始的終身學(xué)習(xí)的初啟祝愿所有幫助、照顧、關(guān)心我的人一愿識盡天下好人二愿讀盡世間好書三愿看盡世間美景