更錦犯初箏惻腌超齡同麴

分孑建場學(xué)實轉(zhuǎn)理輪身操6米G

中國農(nóng)科就研究或就

中國金牝義今&幺物學(xué)學(xué)會

我的痣蟲害2物學(xué)（8家/我宴徐室

二零零四年七月

目錄

口

部6核酸提取

金一：基因組DNA提取

金二：總RNA提取

二部分亞克隆技術(shù)

僉三：質(zhì)粒DNA提取

僉四：DNA片段的酶切

僉五：DNA片段的酶修飾-脫磷一一

金六：DNA片段的連接

僉七：DNA片段的回收

三部分PCR技術(shù)

金八：PCR產(chǎn)物的克隆技術(shù)

A.1：T-載體構(gòu)建

A.2：PCR產(chǎn)物的T-載體克隆一

A.3:PCR產(chǎn)物的平端克隆技術(shù)

僉九：RT-PCR技術(shù)

金十：定量PCR

文庫構(gòu)建技術(shù)

:mRNA的提取及純化

:cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)-cDNA鏈的反轉(zhuǎn)合成

：l,cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)-cDNA鏈的連接、包裝及轉(zhuǎn)染

:2,RACE技術(shù)

核酸雜交技術(shù)

DNA探針的標(biāo)記

Southern雜交技術(shù)

基因及基因產(chǎn)物檢測技術(shù)

DNA的測序技術(shù)

基因表達1,基因的體外快速翻譯

2,基因的誘導(dǎo)表達——

報告基因的應(yīng)用

Western雜交技術(shù)

基因表達輪廓技術(shù)

DD-PCR技術(shù)

SSH技術(shù)

遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)

感受態(tài)細胞制備

重組基因的轉(zhuǎn)化及篩選

原生質(zhì)體芬籬

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)

分子標(biāo)記技術(shù)

RFLP技術(shù)

RAPD技術(shù)

AFLP技術(shù)

SSR技術(shù)

細胞技術(shù)

細胞凋亡

:附錄

第——部分核酸提取

目的基因主要可以通過以下途徑加以分離獲取。對于序列已知或部分已知

的寡聚核甘酸基因片斷或基因可通過DNA的人工合成直接獲?。换蚶肞CR、

RT-PCR及RACE技術(shù)，直接擴增出相應(yīng)的基因片段；對于未知序列的基因或

基因片斷利用dd-PCR等差異顯示技術(shù)、轉(zhuǎn)坐子標(biāo)簽技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、圖

位克隆及電子雜交等手段分離出相應(yīng)目的基因或探針片段，建立基因組文庫或

CDNA文庫，再用探針從相應(yīng)文庫中釣相關(guān)基因。本部分主要介紹基因組DNA

的提取純化，RNA提取純化等實驗方法，其余內(nèi)容見相應(yīng)章節(jié)。

實整——：■國組DNA的提取

DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主

要對象，因此DNA的提取也應(yīng)是分子生物學(xué)實驗技術(shù)中的最重要、最基本的操

作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本談不上進行分子生物學(xué)

方面的實驗。在DNA提取過程中應(yīng)做到1,根據(jù)不同研究需要，保證結(jié)構(gòu)的相

應(yīng)完整性；2,盡量排除其它大分子成分的污染（蛋白質(zhì)、多糖及RNA等）；3,保

證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機溶劑及高濃度的金屬離子。下面結(jié)合

不同的研究對象列出幾種相應(yīng)的DNA提取方法.

方3去1,至因組，途DNA的大量提取

本方法通過液氮研磨粉碎動植物組織、裂解液裂解細胞、有機溶劑抽提，

使進入水相的核酸與蛋白成分分開，在RNA酶作用下，降解RNA,得純度較高

的DNA樣品。

——:儀器高速冷凍離心機、臺式離心機、恒溫水浴、低溫冰箱或冰

柜、冷凍真空干燥器、取液器、電泳儀、水平電泳槽、紫外觀測儀

二二試齊U細胞裂解液（lOOmMTris-HCl5mMEDTA

500mMNaCl1%SDSpH7.5）;飽和酚；氯仿/異戊醇；異丙醇；70%及無水

乙醇；3MNaAC（pH5.2）;RNA酶；TAE緩沖液;載樣緩沖液

三?：操作動植物材料10g（鮮組織）0.5g（干凍組織）

液氮,研碎

10ml裂解液（含1/10體積酚），（65℃預(yù)熱），

加入等體積氯仿，65℃放置30分鐘，

間隔5-10min輕搖一次,

“離心（12000-15000rpm,15min）

上.液

靜止下

0.6體積冷異丙醇，

$0.1體積3MpH5,2乙酸鈉，

挑取絮狀體，70%冷乙醇洗滌，真空干燥，

2mlTE（或水）+lOulRNase,65℃,10-30分復(fù)溶和除RNA

,，等體積酚/氯仿，氯仿抽提

2

（輕輕混勻、冰浴沉淀5min,5000RPM離心5min,取上清）

上清液

2V無水乙醇、1/lOVnaAC,

-20,2或-80℃,30min

10000RPM,lOmin

沉“淀

70%冷乙醇洗滌

真空干燥

v

干粉-20C保存，

或復(fù)溶于0.5-lmlTE或水中，分裝成小體積，-20C或4C保存

四:鑒定

所提DNA進行Agarose膠分析（電泳過程見附），紫外觀測儀觀測，凝膠

成像系統(tǒng)拍攝。

注意:：

1,裂解液要預(yù)熱，以抑制DNase,加速蛋白變性，促進DNA溶解

2,酚一定要堿平衡

3,各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解

4,取各上清時,不應(yīng)貪多，以防非核酸類成分干擾.

5,異丙醇，乙醇.NaAC,KAC等要預(yù)冷，以減少DNA的降解，促進DNA與蛋

白等的分相及DNA沉淀。

6,本方法適用于以DNA片段的酶切分析、Southern印跡等中，具有快

速、省時、省線的特點。

7,此方法也適合菌類基因組DNA的大量提取.

方3去二：/田苗至四組DNA白勺微量提取1去

本方法通過SDS裂解細胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分

——:僅器：同方法一

二二二試齊U二TE、TAE緩沖液；10%SDS;5MNaCL;

20mg/ml蛋白酶K;CTAB/NaCL溶液（10%CTAB,0.7MNaCL4.IgNaCL溶

于80ml水中，緩慢加入lOgCTAB,加熱溶解）；25/24/1,酚/氯仿/異戊醇；

24/1,氯仿/異戊醇；異丙醇；70%及100%乙醇

三:操作

1.5ml對數(shù)生長期細菌細胞

J離心，5000rpm,Imin

溶于500nlTE緩沖液中混勻

30M110%SDS,3.L蛋白酶K,混勻,37℃,1小時

3

100M1NaCL(5M)混勻

801n的CTAB/NaCL,*混勻；65℃lOmin(可不做)

加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液，混勻，

離心12000rpm,4-5min

取上清，以下操作與方法一中有機溶劑抽提、沉淀、干燥、除

RNA、復(fù)溶等步驟一致。

注意1,*此步操作后，離心管中NaCL的濃度不應(yīng)低于0.5M,否則

DNA將與CTAB共沉淀。

2,本法適用于從多糖含量高的樣品中提取DNAO對于菌體樣品，通過此流

程，可以獲得較為完整的DNA分子。

方注三：酉孝母菌莖固組DNA白勺提取

:彳義君昌:同方法一

—:試齊U：SE緩沖液(1M山梨醇，0.1MEDTApH7.5);溶菌酶

(50mg/ml);20%PVP;蛋白酶K緩沖液(10mMTrispH7.60.5%SDSlmM

EDTA);其余同前

1.5ml對數(shù)生長期細菌細胞

“離心，12000rpm,l-2min

溶于590ulSE緩沖液中混勻+10ul溶菌酶37℃,lhr

v離心，12000rpm,8-10min

、I'P-T

譏隊

溶于lOOiaL,0.5.1蛋白酶K,混勻，37℃,lhr

加入1.2ml的CTAB/NaCL,200p120%PVP混勻65℃,30min

等體積酚/氯仿/異戊醇混合液,混勻，

v離心，12000rpm,4-5min

上清，以下操作與方法一中有機溶劑抽提、沉淀、干燥、除RNA、

復(fù)溶等步驟一致。

實驗，總'RNA白勺書是11

完整RNA的提取和純化，是進行RNA方面的研究工作，如Nothern雜交、

mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有RNA

的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即1):樣品細胞或組織的有效破碎；2),

有效地使核蛋白復(fù)合體變性；3),對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；4)有效地

將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；5),對于多糖含量高的樣品還牽涉

到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目

前階段主要可采用兩種途徑，1),提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；

4

2),直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進入有機相而RNA留在水

相。第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很

低。

方法——：總、RNA白勺試齊U盒，版速提取

一些公司推出的總RNA提取試劑盒，可以用來制備高質(zhì)量的可用于建庫的

RNA.該總RNA純化系統(tǒng)采用兩種著名的RNA酶抑制劑，異硫氟酸弧(GTC)和

疏基乙醇,加上整個操作都在冰浴下進行,這樣就能顯著降低RNA的降解速率。

GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復(fù)合體的解離，使RNA與

蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。而進一步從復(fù)合體中純化RNA,則根據(jù)

Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法進行,采用酸性酚一氯仿混合液抽

提。低pH值的酚將使RNA進入水相，這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和

DNA分離。水相中的RNA可用異丙醇沉淀濃縮。進一步將上述RNA沉淀復(fù)溶于

GTC溶液中，接著用異丙醇進行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所

有殘留的蛋白質(zhì)和無機鹽，而RNA中如含無機鹽，則有可能對以后操作中的一

些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。

恒溫水浴,冷凍高速離心機,紫外分光光度計,取液器，電泳儀，電泳槽

—:試劑

RNA提取試劑盒,0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC),75%乙醇

操作步驟

(一)：細胞或組織破碎

A:彳酸生物材料

1:發(fā)酵3-4天(或?qū)?shù)生長期)的菌體，離心收集菌絲體(動植物材料無

需此步處理)

2:用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體2-3次，并盡量除去殘存的水

3:加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA

4:研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至12ml變性液的容器中勻漿。

B:動植物Z田月包士音芥本才科(適用的樣品量為細胞：108)

1：細胞或組織培養(yǎng):按常規(guī)方法進行

2:深層懸浮培養(yǎng)細胞的破碎：

(1)細胞收集:含一定濃度的細胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中，4℃,3000g離心

5分鐘

(2)細胞洗滌:上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的1xPBS緩沖液洗滌,然后4

℃,3000g離心5分鐘，

(3)細胞破碎:在沉淀細胞中加入15毫升預(yù)冷的變性液，用無菌處理過的勻

漿器勻漿

3:表面培養(yǎng)細胞的破碎：

(1)確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細胞累加后總量達10*

(2)細胞收集:將培養(yǎng)液倒掉,用預(yù)冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次,在培養(yǎng)瓶

5

中加入8毫升預(yù)冷變性液,轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,使細胞溶解,此時可見粘度加大.

（3）用無菌吸管將第一個培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)，溶解細胞,

再吸入第三個培養(yǎng)瓶，以此類推,直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次,然后從

第一個培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液,將所有培養(yǎng)瓶洗一次.

（4）將上述12毫升含細胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50毫升無菌離心管中，勻漿破碎

細胞.

C:植物組織破不卒（適用的樣品量為0.05g組織）

⑴將600ul變性液置于1.5ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘.

（2）將0.05g新鮮組織用液氮冰凍

（3）在液氮下，研磨組織塊

（4）待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌離心管中.

D:動物組多只破不卒（適用的樣品量為1克組織）

⑴將12毫升變性液置于50毫升離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘.

（2）在上述管中加入1克新鮮或冰凍動物組織，勻漿粉碎.

注1：研磨組織塊用于RNA提取的樣品，必須是新鮮的細胞或組織，如采樣后，不

能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70C的冰箱中保存。

2:變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷

）：RNA白勺寺由提

在經(jīng)變性液勻漿的細胞或組織600ul+60ulpH4.0的2M乙酸鈉徹底混

”勻，可用漩渦振蕩器

600ul酚'氯仿'異戊醇（25\24\1）,徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒

”冰裕中10-15分鐘，

離心，4C,10000g,20分鐘

上層水相吸至無菌離心管中+等體積的異丙醇,-70℃,30分鐘沉淀RNA

立離心4℃,10000g,20分鐘

沉淀RNA,冷凍干燥15分鐘，RNA沉淀重新溶于300ul變性液中，可

振蕩（有時為了幫助溶解，可在65C加熱，但時間應(yīng)極短）

60ulpH4.0的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器

I600ul酚'氯仿'異戊醇（25\24\1）,徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒

|冰裕中10-15分鐘，

離心，4℃,10000g,20分鐘

上層水相吸至無菌離心管中

’等體積異丙醇二次沉淀（-70℃,30分鐘），75%乙醇洗沉淀,沉淀冷

凍干燥，復(fù)溶于去RNA酶的水中（對于準(zhǔn)備長期保存的RNA可加入pH5.0的乙

酸鈉至終濃度為0.25M,再加入2.5體積的乙醇，-70c保存。）

注：1變性液組成：25g異硫氟酸胭溶于33mlCSB（42mMpH4.0乙酸鈉、0.83%

十二烷基肌氨酸鈉、0.2mM。-疏基乙醇），65C溶解，過濾滅菌，4℃預(yù)冷。

2酸性酚配制：55℃時，500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分

6

層后,去上清,再反復(fù)加500ml50mM,pH4.0乙酸鈉，直到pH<4.1。

方法二：氤彳七鋰3去提取，途RNA

本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA,

其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA,具有快速簡潔的長處，但也存

在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片斷丟失的缺陷。

儀器：同上

試劑二

氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,過濾滅菌】

懸浮液【10mMTris-HCL(pH7.6),ImMEDTA(pH8,0),0.5%SDS]

其余同上

操作步深二

1：對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5-10ml氯化鋰-尿素溶

液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細胞(107個細胞/ml),則每克組織

或細胞加入0.5ml氯化鋰-尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中

2：勻槳液在0-4℃放置4小時后，12000g離心30分鐘

3:取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液，重復(fù)步驟2

4：沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/

氯仿/異戊醇在室溫放置15-30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘

5：取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉(pH5.2)及2倍體積的乙

醇,-20℃放置1小時，5000g離心。

6：70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

7：RNA溶解液溶解沉淀，得RNA,分裝，于-70℃保存。

力~3去三_:白一拼V3去

本方法適合于病毒RNA的提取

儀器二同上

試齊蛋白酶K(終濃度50ug/ml)

2x緩沖液：1%SDS20mMTris-HCL(pH7.6)0.2MnaCL

其余同上

操作:

1,提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K,37C40-50分鐘

2,加入等體積65C預(yù)熱的酚溶液，輕徭，在65C保溫5分鐘后再輕徭。

3,離心，取上清，氯仿抽提一次

4,取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉(pH5.2)及2倍體積的乙醇，-

20℃放置1小時，5000g離心(10000g,lOmin).

5,70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

6,RNA溶解液溶解沉淀，得RNA,分裝，于-70c保存。

上面介紹了一些核酸(DNA、RNA)提取方法，在進行具體實驗時，應(yīng)根據(jù)

研究對象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對上述方法在操作步驟和試劑使用量上作

7

一定的修改。以下一些原則和建議對核酸提取的操作可能會有一定的裨益。

1:在核酸提取時，為了增加細胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋

放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K,在確保沒有核酸水

解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時間越長越好。

2：有時在使用蛋白酶時，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖

液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL,并且可將反應(yīng)溫度提高到50-60℃,并

將反應(yīng)時間縮短到15-25min,但酶用量必須提高10-20倍。溶菌酶使用時

緩沖液中需加EDTA,因游離金屬離子對酶有抑制。

3:許多植物材料中富含酚，在細胞破碎時，在多酚氧化酶作用下，被氧化成

有色的銀類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和疏

基乙醇對降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提

取時將酚從核酸成分中游離。且PVP與疏基乙醇作為強還原劑可防止多酚的褐

變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。

4：許多生物材料在提取核酸時，都會遇到多糖的污染問題，具體表現(xiàn)為有機

溶劑沉淀時，沉淀很多，但復(fù)溶時，大量沉淀不溶，電泳觀察時核酸含量很

低?？朔嗵俏廴究刹捎靡韵乱恍┺k法

(1)CTAB多次抽提。

(2)在有機溶劑沉淀時先稀釋樣品濃度(可到10倍左右)，對低濃度

樣品再進行沉淀。

(3)在有機溶劑沉淀時選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時氯化

鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉

淀核酸時，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達到去多糖

的作用。但高濃度的鹽存在會影響核酸的進一步操作，因此必須用乙醇多

工人洗^洛?鹽^

5:在核酸提取質(zhì)，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強于氯仿，但

酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會殘留

酚，而酚的存在將對核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強的抑制，因此在操作中可單用氯仿作

變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在

有機溶劑沉淀時一定要用氯仿從抽提。

6：在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，

尤其在提DNA時，更要避免劇烈操作。

7：在沉淀核酸時可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強于異丙醇，所以一般用

2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時，用異丙醇沉淀可部分克服這種污

染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。

8:在提取核酸時，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機溶劑沉淀時間，-70C下

>30min;-20℃過夜將有助于增加核酸的沉淀量。

9：在核酸提取過程中有機溶劑沉淀后復(fù)溶時可加水因此時離子濃度可能較

高，而到高度純化后低溫保存時最好復(fù)溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲

8

藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時要求以高濃度保存，低

濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。

10:核酸提取后可通過PCR、RT-PCR直接擴增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)

建文庫、然后由RACE、dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標(biāo)記技術(shù)、差異雜交

或文庫扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫中篩選出完整基

因。有關(guān)這些內(nèi)容在下面各篇幅中會詳細介紹。

第二匐3分：至因克隆技術(shù)

目的基因的克隆是分子生物學(xué)實驗中的核心內(nèi)容，起著承上啟下的作用，

通過克隆技術(shù)可實現(xiàn)目的基因的無限擴繁、長期保存的目的；利用該技術(shù)能實

現(xiàn)基因重組、基因改造、構(gòu)建工程菌和轉(zhuǎn)基因動植物?；蚩寺〖夹g(shù)主要包括

載體的獲取、酶切、脫磷、連接和轉(zhuǎn)化及篩選、鑒定等內(nèi)容。本部分將介紹除

基因鑒定外的其他內(nèi)容。

實馬僉三:質(zhì)粒DNA白勺提取不口名屯彳匕

整合外源DNA并將其帶入宿主細胞的過程是分子克隆的關(guān)鍵。而在此過程

中攜帶外源基因的工具為載體。載體有1）在宿主細胞中具獨立復(fù)制能力；2）

帶抗性等選擇標(biāo)記；3）有合適的限制性內(nèi)切酶位點，可插入一定片斷長度的外

源DNA而不影響自身復(fù)制的特點。目前經(jīng)基因操作已構(gòu)建了一大批適合不同宿

主細胞，有不同選擇標(biāo)記的克窿載體或表達載體。這些載體有以下幾類：1）宿

主為大腸桿菌的細菌質(zhì)粒、Lamda噬菌體、噬菌粒、噬菌體M13、拈粒和卡粒

等；2）宿主菌為酵母的以酵母人工染色體克隆系統(tǒng)（YAC）為代表的酵母菌質(zhì)

粒載體及酵母菌與大腸桿菌穿梭質(zhì)粒載體；3）以枯草桿菌為載體的枯草桿菌質(zhì)

粒載體和芽雹桿菌與大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒載體；4）宿主為植物細胞的Ti質(zhì)

粒、植物病毒及帶有真核啟動子的改造質(zhì)粒；5）動物細胞為宿主的動物病毒和

以動物病毒為基礎(chǔ)改造的穿梭質(zhì)粒。在上述所有載體中通用型大腸桿菌質(zhì)粒載

體因具有通用引物序列、多克隆位點區(qū)具極多的內(nèi)切酶特異序列、許多具。互

補性質(zhì)等特點而成為最基本的通用克隆載體。

在克隆操作中往往都是將待克窿片斷先克隆到通用大腸桿菌載體的多克隆

位點區(qū)，或直接測序或根據(jù)需要再克隆到其他載體上。大腸桿菌質(zhì)粒多為一些

雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，其大小范圍從lKb-200以上Kb不等，它們是獨立于

細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒的存在能賦于菌體一

些特殊的表型，這些表型主要有對抗生素的抗性、修飾酶等。

質(zhì)粒DNA的提取根據(jù)實驗?zāi)康牟煌梢杂胁煌姆椒ǎ静襟E多為

三步，第一細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增，第二細菌菌體的裂解，第三質(zhì)粒DNA的純

化。菌體裂解方法不同，決定了質(zhì)粒DNA提取方法的差異，目前菌體裂解方法

主要有煮沸法，SDS法,堿解法,Triton-溶菌酶法等。質(zhì)粒DNA的純化方法主

要有梯度離心法、柱層析法等，但由于目前所用質(zhì)粒的復(fù)制量極大，小量常規(guī)

9

制備的質(zhì)粒既可以滿足內(nèi)切酶圖的繪制、細菌轉(zhuǎn)化、特定DNA片段的分離、常

規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等方面的工作需要.在質(zhì)粒DNA提取中，質(zhì)粒DNA的質(zhì)量

和產(chǎn)量在很大程度上受培養(yǎng)條件的影響，通過一些實驗發(fā)現(xiàn)，下列培養(yǎng)方式能獲

得較好的結(jié)果：

1培養(yǎng)應(yīng)用菌齡不超過4天的平板單菌落作為起始菌

2培養(yǎng)菌應(yīng)在37℃,220rpm下，生長16-18小時

3不能用經(jīng)儲藏的培養(yǎng)菌直接進行質(zhì)粒提取制備。

下面介紹幾種質(zhì)粒DNA提取的方法：

方3去一：堿解3去提取■屋粒DNA

-本方法適合于質(zhì)粒DNA的微量提取

超凈工作臺、超級恒溫器或恒溫水浴、臺式離心機、培養(yǎng)箱、取液器、搖床、

冷凍真空干燥器、低溫冰箱或冰柜、電泳儀、電泳槽、紫外觀測儀

—:試劑

1：SolutionI50niM葡萄糖，

25mMTris-HCl(pH8.0)

lOniMEDTA(pH8.0),高壓滅菌，4℃保存

2：Solution110.2MNaOH,1%SDS,現(xiàn)配現(xiàn)用

3：Solution1115MKAC60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4℃保存

4：3MNaACpH5.2高壓滅菌，4c保存

5:氨節(jié)青霉素50mg/ml,

6:溶菌酶

7:酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)

8:異丙醇

9：LB培養(yǎng)基

10:電泳試劑見附

11:TE緩沖液

三：操作步驟

含氨卞(lOOug/ml)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體37℃200rpm過夜

I

吸取1.5ml

J離心，5000rpm,Imin

譏灰

(充分去除LB培養(yǎng)液)

加入預(yù)冷的lOOulSolutionI,充分振蕩懸浮

加入200ulSolutionII,顛倒徭勻后冰浴中3-5min,

加入150ul預(yù)冷SolutionIII混勻，冰浴5min

v離心，12000g,5min

取上清

1o

酚/氯仿/異戊醇、氯仿各一次，離心5000g5min

上清

|0.6體積的異丙醇，室溫，5min,離心，12000g,,5min

沉淀冷凍干燥

懸于50pIdd水或TE

RNA酶至20ng/ul37-65℃,30-60分鐘(可不做)

酚/氯仿、氯仿抽提、乙醇沉淀(-70℃,15min/-20℃,2hr)

、，離心10000g,5-10min

沉淀?凍干?復(fù)溶

-20C保存1電泳鑒定

注1：試劑中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，減少DNA的降解

2:試劑中所用EDTA有抑制DNase的作用，還能降低離子濃度，而高濃度離

子對溶菌酶有抑制作用。

3:試劑中所用NaOH能使DNA變性，KAC能使DNA復(fù)性,并有助于蛋白等其

它大分子成分沉淀。

4：如A,不用酚/氯仿抽提;B,LB培養(yǎng)基殘留；C,提取中在溶液II中時間過

長，導(dǎo)致共價閉合環(huán)狀DNA不可逆變性，則可能影響酶切。

質(zhì)粒提取方法還有很多，如要進行重組質(zhì)粒的植物轉(zhuǎn)化或質(zhì)粒測序則應(yīng)進

行氯化鈍梯度離心，或直接采用試劑盒提取。

另試劑盒提取可同時進行許多質(zhì)粒的提取，能在最短時間內(nèi)獲取高質(zhì)量、

高濃度的質(zhì)粒DNA

如果要提取大質(zhì)粒DNA則建議使用溶菌酶裂解細胞，以釋放質(zhì)粒DNA

實臉?biāo)?DNA片斷的聯(lián)切技術(shù)

限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核甘酸序列的DNA水解酶,

這類酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用促進了以DNA重組為基礎(chǔ)的生物工程技術(shù)的迅猛發(fā)展。該

類酶是體外剪切基因片段的重要工具，基因物理圖譜的繪制、核甘酸序列的測

定、基因片段的重組，重組子的篩選、探針的制備及各種雜交、測量基因的拷

貝數(shù),基因文庫構(gòu)建，分子標(biāo)記等都離不開限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用。另外以限制性

內(nèi)切酶為基礎(chǔ)的各種限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析，促進了分子遺傳學(xué)、

分類學(xué)等相關(guān)學(xué)科的應(yīng)用和發(fā)展?？梢赃@么說，沒有限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)

用就沒有現(xiàn)代意義上的分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)，也就不會有任何基因工程產(chǎn)

品。而對于從事分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域研究工作的人員講來，如果不能很好地

了解和掌握內(nèi)切酶技術(shù)，那就根本不可能開展這方面的任何工作。

本部分實驗主要通過EcoRI,HindHI兩種限制性內(nèi)切酶對入DNA的單

酶切、雙酶切及部分酶切的操作，使學(xué)員能掌握內(nèi)切酶的實驗操作技術(shù)

--::

離心機、恒溫水浴、取液器、電泳儀、電泳槽、紫外觀測儀

—：試劑

11

EcoRI,HindIII,入DNA/HindlH及入DNA/EcoRI標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（或其他DNA樣

品）（濃度＞0.5ug/u1）TAE緩沖液

三：操作

（一）EcoRI、HindIII單酶切及雙酶切

1,取2支干凈、滅菌新Eppendof管，分別按下表加入

A（uDB（|n1）

滅菌水1313

EcoRI緩沖液2

HindHI緩沖液2

入DNA（或質(zhì)粒DNA）44

EcoRI1

HindIII1

總體積2020

2,37c保溫1-4小時

3,保溫結(jié)束后65-70C10min滅活酶（如為熱穩(wěn)定性酶，則用氯仿抽提）

4,取2口1左右的反應(yīng)液加入2*1電泳加樣緩沖液，電泳

（二）EcoRI、HindIII雙酶切

1,取一支干凈、滅菌Eppendof管,按下表加入各種試劑

加入試劑體積（口1）

滅菌水12

MULTbuffer2

入DNA（或質(zhì)粒DNA）4

EcoRI1

HindIII1

總體積20

2,37℃保溫1-2小時

3,保溫結(jié)束后65-70℃10min滅活酶（如為熱穩(wěn)定性酶，則用氯仿抽提）

4,取2*1左右的反應(yīng)液加入2口1電泳加樣緩沖液，電泳

9主意;1,樣品加入次序為水、緩沖液、DNA最后為酶，不應(yīng)顛倒，

2,加酶步驟要在冰浴中進行，在加酶前應(yīng)先將水、緩沖液及待切DNA

混勻

3,反應(yīng)體積中水的量要盡量少，即反應(yīng)體系的體積要盡量少，一般水

解0.2-lug模板DNA時，應(yīng)將體積控制在20-30U1內(nèi)。但要保證所加酶的體

積不高于總體積的1/10,因為限制性內(nèi)切酶是保存于50%甘油中的，如加酶體

積高于總體積的1/10,則反應(yīng)液中甘油濃度將大于5%,而此濃度將抑制內(nèi)切

酶活性。

4,為了控制反應(yīng)體積和促進反應(yīng)進行，要求模板DNA的濃度應(yīng)很高，

否則反應(yīng)體系中DNA濃度太低則將引起酶反應(yīng)動力學(xué)改變、降低酶解效果，此

時不得不增加反應(yīng)體積；而一般為了增加DNA儲藏的穩(wěn)定性，DNA多保存在TE

12

緩沖液中，如反應(yīng)體系中過多加入模板DNA溶液則勢必造成反應(yīng)體系中EDTA

濃度升高，而對酶產(chǎn)生抑制。因此如底物DNA濃度過低則應(yīng)進行濃縮。

5,本實驗中雙酶切時，因兩種酶的緩沖液鹽濃度要求相同，所以，可

在同一反應(yīng)體系中完成雙酶切。但如進行雙酶切時，兩種酶所需緩沖液鹽濃度

要求不同，則不能將兩種酶同時加入同一體系，進行反應(yīng)，此時可采取下列處

理辦法

a：先用在低離子強度的緩沖液中活性最高的酶切割DNA,然后加入適量的

NaCL及第二種酶，繼續(xù)保溫。

b：使用所有限制酶均可作用的單種緩沖液(谷氨酸鉀緩沖液)。

C:一種酶水解完后，進行有機溶劑抽提，沉淀、干燥后再復(fù)溶然后進行第

二種酶切。

在上述3種方法中遇到最多的可能為C

6,在水解結(jié)束滅活酶時可采用65℃加熱10分鐘或加EDTA至終濃度

二者各有利弊，加熱簡單但對有些酶滅活不徹底。EDTA對酶的滅活徹

底，但EDTA存在將使連接反應(yīng)變得極為困難，因此在連接前要求重新用有機

溶劑抽提，這將增加操作難度和導(dǎo)致DNA的損失。

有關(guān)DNA限制性內(nèi)切酶使用中的一些其他問題可參見附錄。

實馬僉五:臉切片斷的月兌程埠技術(shù)

在對DNA片段的修飾中，脫磷酸化反應(yīng)是一個重要內(nèi)容，該反應(yīng)有堿性磷

酸化酶催化，該酶可使線狀DNA上去除"磷酸基團，而DNA的脫5,磷酸基團

是基因重組、載體構(gòu)建中防止載體DNA自身聯(lián)接、環(huán)化的重要途徑，載體經(jīng)單

酶切線性化后，3,端為羥基、5,端為磷酸基，在連接酶作用下將以極大比例發(fā)

生載體自連，而5,脫磷后，載體在5,與3,位均為羥基不能自連只有與帶5,磷酸

基的外源片斷連接，載體與外源片斷間形成一個磷酸二脂鍵和一個缺口，缺口在

轉(zhuǎn)移進細胞后修復(fù).另外脫磷作用還可發(fā)生在RNA、DNA、三磷酸腺甘、脫氧三

磷酸腺昔的5,端，這個反應(yīng)是進行探針標(biāo)記操作中的重要環(huán)節(jié)。

——：儀器離心機恒溫設(shè)備真空干燥機取液器

—：試劑

堿性磷酸酶、入DNA酶切片段、酚、氯仿、0.5MEDTA(pH8.0)、SDS、

TE緩沖液、電泳緩沖液、7.5MNH4AC(pH7.5)

10x堿性磷酸酶緩沖液：lOmMZnCL

1OmMMgCL

lOOmMTris-HCL(pH9.0)

彳小

1:在實驗四所得DNA限制性內(nèi)切酶片段中加入

10x堿性磷酸酶緩沖液10M1

堿性磷酸酶(0.Olu/pmolends)l-2ul

ddH20到lOOul

13

對于5,突出則37℃下溫浴30分鐘，再加入lulCIAP（O.Olu/pmolends）,37℃

下溫浴30分鐘.

對于平末端或3,突出末端，則37℃下溫浴15分鐘，56℃下溫浴15分鐘，再加

入lulCIAP（0.Olu/pmolends）,37℃下溫浴15分鐘.56℃下溫浴15分鐘

2：溫浴結(jié)束后加入EDTA（pH8.0）至終濃度分別為10mM,65℃加熱

20min,以滅活堿性磷酸酶

3：用酚、氯仿各抽提一次

4:加入1/2體積NH4AC,充分混勻，再加入2體積的乙醇，-20℃放置

2hr（或-70C30分鐘），12000g離心10分鐘，沉淀DNA。

5:冷70%乙醇洗沉淀一次

6:TE溶解（終濃度為100叱/口1）,-20C保存

四:棒測

將脫磷片斷中加入連接酶，以加入連接酶的非脫磷片斷作為對照，，連接反應(yīng)

后，Agarose電泳分析，脫磷片斷不能連接，而非脫磷對照片斷能連.

3主:1,pmolends=3.04xugDNA/DNA的堿基數(shù)

2,在上述幾個實驗中，有機溶劑沉淀時所用NaAC的pH最好為7.2或用7.5M

的NH4AC,如用pH5.2的溶液則有可能導(dǎo)致EDTA沉淀量增加，影響以后的連

接反應(yīng)。

3,堿性磷酸酶有兩類BAP（細菌堿性磷酸酶）和CIP（小牛腸道堿性磷酸

酶），因BAP耐熱，滅活時必須采用有機溶劑抽提法，而CIP在68C10%SDS

條件下級可滅活，因此實驗中一般都采用CIP。

實馬僉六二至四的重組連接技術(shù)

DNA酶切片段的連接是分子生物學(xué)實驗中又一關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)是基因重

組，基因改造的重要中間環(huán)節(jié)。兩DNA片段相鄰的5,磷酸和3,羥基間可由連

接酶催化形成磷酸二酯鍵，這個連接反應(yīng)在體外一般都有大腸桿菌DNA聯(lián)接酶

和T4DNA聯(lián)接酶催化，但分子生物學(xué)實驗中主要采用T4DNA聯(lián)接嚼，因該酶在

正常條件下，即能完成連接反應(yīng)。在分子生物學(xué)實驗中連接酶主要用于1）基

因重組中載體與外源基因的連接；2）接頭與DNA片斷的連接，這種連接一般

發(fā)生在文庫構(gòu)建、分子標(biāo)記的AFLP及差異表達的研究等中。連接反應(yīng)可在溶

液中進行也可在瓊脂塊中進行。本課程中在AFLP、文庫構(gòu)建、PCR片斷的克隆

等中均有連接的內(nèi)容，在本部分僅以重組克隆為目的介紹相應(yīng)的連接類型。在

基因重組克隆中外源DNA與載體的連接是承上啟下的一步操作，根據(jù)連接片斷

末端類型不同，連接方式有粘端連接、平端連接等和平粘端連接及單堿基配對

的T-載體連接。其中粘端連接的效率最高，粘端連接與平粘連接中外源DNA

片斷在載體中的插入有方向性。平端連接的效率最低，且載體發(fā)生自連的比例

較高，因此在克隆操作中為了克服平連的弊端，通常可通過l）TdT酶在載體和

外源DNA片斷上轉(zhuǎn)移一互補序列（核甘酸投影法）；2）在載體和外源DNA片斷

上加上人工接頭，變平連為粘連。下面擬通過T4DNA聯(lián)接酶對酶切片段的連接

14

操作，使學(xué)員掌握這一DNA片段的連接操作技術(shù)。

A：班液中迂接

——：儀器離心機、恒溫設(shè)備、真空干燥機、取液器

—：試劑

T4DNA聯(lián)接酶

10xT4DNA聯(lián)接酶緩沖液

200mMTris-HCL（pH7.6）、50mMMgCL2>5mMATP、50mMDTT

500ng/ml/牛血清白蛋白（可不用）

入DNA/HindHI酚/氯仿、酚、氯仿、TE緩沖液、電泳緩沖液、3M

NaAC（pH5.2）

彳后：

1：取干凈、滅菌Ephondof管，安下表加入各試液

T4DNA聯(lián)接酶緩沖液lul

載體DNA片斷Ing

插入目的片斷Xng

連接酶lu（平末端,如為粘端連接，則酶量可小于lu）

加無菌水到10ul

X=目的片斷與載體片斷的分子比例x載體ng數(shù)x目的片斷的堿基數(shù)/載體ng

數(shù)

（目的片斷/載體片斷的分子比例一般為3/D

2：連接反應(yīng)

22℃保溫3小時或4c過夜（Promega連接酶，粘端連接）

或22-26℃lhr（BRL連接酶，粘端連接）

或22℃4-16hr（Promega連接酶，平端連接）

或14C16-24hr（BRL連接酶）

B：月交內(nèi)連接：該方法是一種快速克隆技術(shù)，將要重組連接的外

源DNA片斷用低熔點瓊脂糖分離，在紫外燈下切下待克隆片斷，溶化后加入緩

沖液、載體DNA、連接酶直接連接。這種連接的待克隆片斷既可以為酶切基因

組片斷也可為PCR片斷，既可平連也可粘連，但連接效率較溶液中連接要低的

多，但這種連接省去了待克隆片斷的回收純化操作。這種連接方法要求目的

DNA量、載體量及酶量都要增加。

——：儀瞿：同A

—：試齊U：同A

1：低熔點瓊脂糖膠分離外源DNA片斷，在紫外燈下切下目的片斷

2：65c保溫徹底溶化瓊脂，取18ul（約0.1-0.5ug）于一新管內(nèi)再加入2ul

載體（約0.01-0.05ug）混勻，37℃5-10min

3:配制2xT4DNA連接酶反應(yīng)體系20ul,（其中含2xT4DNA連接酶緩沖液和

不低于2uT4DNA連接酶）混勻，點動離心后置于冰浴

15

4：將預(yù)冷的2xT4DNA聯(lián)接酶反應(yīng)體系20ul加到“2”中含待連接DNA樣品管中

立即混勻后立即置于冰浴中待凝固

5：置于12C連接過夜。

6:此連接片斷可直接用于轉(zhuǎn)化，即轉(zhuǎn)化前65C溶化，取5-lOul轉(zhuǎn)化。

注1：粘端連接時模板DNA用量控制在0.1-0.5ug間，而平連時模板量應(yīng)

>0.5ugo拈連時溫度可在4C過夜，而平連時最好在12-16C過夜

2：用于轉(zhuǎn)化的連接片斷最好不要冰凍

3:膠內(nèi)連接時，應(yīng)用TAE緩沖液，而不應(yīng)用含TBE的膠，因硼酸能與瓊脂糖

中的方式糖單體或多聚體結(jié)合成難溶復(fù)合物，這種復(fù)合物使膠難熔解，將抑制

連接酶

4：在紫外光下觀察切割條帶時，操作要快，DNA條帶在紫外光下的暴露時間應(yīng)

盡量短，因UV會引起DNA變異。

實驗七二DNA片比斤白勺回U攵技術(shù)

目的DNA片段的回收技術(shù)是重組DNA中的關(guān)鍵技術(shù)，回收是指從電泳介質(zhì)

中純化出目的片斷。目前待回收的片斷主要有酶切片斷和各種PCR片斷；回收

的介質(zhì)主要有瓊脂糖和PAGE;回收的方法主要有樹脂回收、微量柱回收、玻

璃奶回收、液氮凍凍融回收及透析袋大量回收等，下面分別介紹樹脂、微量柱

及液氮凍凍融回收技術(shù)。

方法——：樹月旨回收技術(shù)

本方法特別適合于PCR片段的回收，具有純度高、操作簡潔等特點，經(jīng)

此方法回收的片段可有效的用于重組載體構(gòu)建。通過15分鐘的純化過程,PCR

產(chǎn)物即能被有效地從含引物二聚體、非特異性擴增引物片斷等混合物中分離出

來，成為高度無鹽的、不含其他大分子成分的純化片斷。在較寬的分子量范圍

內(nèi)有較高的回收效率。下表為不同長度的DNA片斷,在室溫條件下，用此純化系

統(tǒng)直接純化時，各自相應(yīng)的回收率。

dsDNA長度bp20015003002007550

回收率%>6096996932

一：儀器離心機電泳議電泳槽取液器微量真空裝置抽濾裝置

二：PCR片斷純化試劑盒80%異丙醇

三：操作

（一）從瓊脂糖介質(zhì)中純化DNA片斷

1：用低熔點或常規(guī)熔點瓊脂糖電泳對PCR擴增片斷進行分離，該電泳安常規(guī)方

法進行，緩沖液為TAE.

2：在凝膠上,找到所需條帶，然后用潔凈并滅菌的小刀將其切下接近300微升瓊

脂糖凝膠（約300毫克）

3:如果切下的瓊脂糖為高融點的則安下面A步驟進行,如為低融點瓊脂,則安B

步驟進行。

A：將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中，加入1毫升純化用樹脂,

16

然后將其置于65℃水浴保溫5分鐘，或保溫至瓊脂完全溶解。

B：將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中，然后將其置于70C水

浴保溫至瓊脂完全溶解,然后加入1毫升純化用樹脂到融化好的瓊脂中，將其混

合20秒,但不要振動。

4:為每一個待回收片斷準(zhǔn)備好一個微量柱.在每個柱的開口處,聯(lián)上一針筒，然

后將這些柱與針筒的復(fù)合體與抽真空設(shè)備相連

5:在柱-針筒復(fù)合體中加入樹脂/DNA混合物，打開真空裝置，將樹脂與DNA的混

合物抽到微量柱中，斷開真空裝置與柱的連接。

6：洗柱,加入2毫升80%的異丙醇，打開真空裝置,使這些洗柱液完全流經(jīng)微量

柱。

7：繼續(xù)真空30秒以干燥樹脂,注意此干燥時間不能超過30秒。關(guān)閉真空，移去

針筒。將微量柱轉(zhuǎn)移至一1.5毫升微量離心管中。10000g離心2分鐘，以徹底

除去殘存的異丙醇。

8:將微量柱，再轉(zhuǎn)移至一新的1.5毫升微量離心管中，加入50微升水或TE緩

沖液，靜置1分鐘（在頭30秒,DNA仍將吸附于柱上），10000g離心20秒，以洗

脫DNA片斷，所得純化后的DNA片斷可直接用于連接反應(yīng)或在-20C保存。

注：1對于＞3Kb的片斷在純化回收時，洗脫前，如先將水或TE緩沖液預(yù)熱到

65-80C,則將能有效的提高回收率。待洗脫片斷＞3Kb時，洗脫液溫度應(yīng)為65-

80c待洗脫片斷＞20Kb時，洗脫液溫度應(yīng)達80C。

2應(yīng)用TAE緩沖液，而不應(yīng)用含TBE的膠，因硼酸能與瓊脂糖中的方式糖單體

或多聚體結(jié)合成難溶復(fù)合物，這種復(fù)合物使膠難熔解。

3:在取用純化柱樹脂中的液體前，應(yīng)將樹脂充分?jǐn)噭?，如樹脂中出現(xiàn)結(jié)晶或結(jié)

塊,則應(yīng)將樹脂在25-37C,溫?zé)?0分鐘，冷卻至30℃使用。樹脂本身不會溶。

4：在紫外光下觀察切割條帶時，操作要快，DNA條帶在紫外光下的暴露時間應(yīng)

盡量短，因UV會引起DNA變異。

.■

PCR回收示意圖

17

(二)尿素丙烯酰胺變性膠中分離DNA片斷

1：從變形膠上切下待回收片斷，將其放如一微量離心管中。

2:加入100微升TE緩沖液，37c保溫30分鐘以上。

3:將上清液吸入一新管中，加入1毫升樹脂，振蕩20秒以混勻樹脂與清液

4-8:同(一)中

方法二：微量柱法純化DNA片段

本方法具有操作簡單的特點，特別適合于PCR片段、酶切片段等的回收

一：儀器：同方法一

二：試劑：微量柱、其它試劑同方法一

三：操作：

1：紫外燈下從膠上切下目的片段，放入一Epphendof管中

2：離心管在-20c冷卻5-10分鐘

3：將微量柱下套上一Epphendof管，將冷卻的膠條裝進微量柱中，4℃

12000rpm離心10分鐘

4：棄微量柱，用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液體各一次

5:1/10體積乙酸鈉+2體積無水乙醇沉淀2小時

6：70%乙醇洗沉淀，真空干燥，復(fù)溶于dd水或TE中

方法三：液氮凍融法

-：儀器同方法一

-：試劑：液氮，其余同方法一

三：操作：

1：紫外燈下從膠上切下目的片段，放入一Epphendof管中

2：離心lmin,加入500U1TE,200ul酚/氯仿混勻

3:離心管放入液氮中10-15min,再室溫放置，反復(fù)凍融

4：用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液體各一次

5:1/10體積乙酸鈉+2體積無水乙醇沉淀2小時

6：70%乙醇洗沉淀，真空干燥，復(fù)溶于dd水或TE中

方法四：從變性PAGE中純化DNA片斷的常規(guī)方法

一：儀器：同方法一

二：試劑：PAGE電泳試劑TE無水乙醇70%乙醇

洗脫緩沖液I(10mMTris-HCLpH8.00.IMmEDTApH8.0)

洗蕨緩沖液11(0.5MNH4AClOmMTris-HCLpH8.00.IMmEDTApH8.0)

三：操作：

1：PAGE電泳，如EB染色的則在紫外燈下切下目的片斷，如齦染或其他非放

染色的則在關(guān)下切下目的片斷

2：用少量脫緩沖液I將目的片斷膠條洗至一Eppendorf管中，用玻棒將凝膠

搗碎，用150