基因工程賦予生物新的遺傳特性目錄DNA的粗提取和鑒定01基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性0201DNA的粗提取和鑒定DNA的粗提取和鑒定一、原理1.實(shí)驗(yàn)原理從目標(biāo)生物中提取分離DNA，是進(jìn)行基因工程操作的基礎(chǔ)。利用DNA與其他物質(zhì)成分在物理、化學(xué)性質(zhì)上的差異，通過一定的方法，去除其他成分，提取DNA。（1）幼嫩的植物材料經(jīng)過冷凍后再研磨細(xì)胞結(jié)構(gòu)容易被破壞（2）SDS處理材料

，能使核蛋白變性并與DNA分離（3）EDTA能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解DNA的粗提取和鑒定（4）DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度高，且Na＋與DNA形成鈉鹽，鈉鹽不溶于酒精（5）某些蛋白質(zhì)能溶于酒精，在提取液中加入

95%的冷酒精，能使DNA鈉鹽形成絮狀沉淀物而析出2.檢驗(yàn)原理在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍(lán)色00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度DNA的粗提取和鑒定二、材料用具1.選材取材原則：原則上含有DNA的生物材料都可以采用，但是優(yōu)先考慮一下幾個(gè)方面（1）材料是否容易獲?。?）DNA含量的多少（真核生物比原核生物細(xì)胞內(nèi)DNA含量高、生殖細(xì)胞內(nèi)DNA含量低）（3）是否容易提?。ㄖ参锛?xì)胞有細(xì)胞壁不易破碎）DNA的粗提取和鑒定√√√×思考：為什么不能選用豬血作為實(shí)驗(yàn)材料？不能選用哺乳動物血液，因?yàn)椴溉閯游锍墒旒t細(xì)胞沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎沒有DNA（雞血可以）DNA的粗提取和鑒定2.試劑①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用DNA的粗提取和鑒定三、方法步驟1.研磨：稱取10g香蕉果肉，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨2.過濾：在漏斗中墊上尼龍紗布，將研磨液過濾入離心管中3.離心：用天平稱量裝有液體的離心管的質(zhì)量，將質(zhì)量相近的離心管配對，放置于離心機(jī)相對位置。以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，取上清液倒入小燒杯中。DNA的粗提取和鑒定4.加冷酒精：向小燒杯中倒入體積是上清液兩倍的冷酒精，靜置3～5min，可見白色的絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩攪動，絮狀物會纏在玻璃棒上析出DNA5.鑒定：取兩支試管，一支試管中加入提取出的絮狀物，并加入2mL二苯胺試劑；另一支只加入2mL二苯胺試劑。用95

℃水浴鍋加熱10min，注意觀察兩支試管中溶液顏色的變化DNA的粗提取和鑒定四、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象對照組顏色無變化（不加入絮狀物）實(shí)驗(yàn)組顏色變藍(lán)（加入絮狀物）DNA的粗提取和鑒定思考1.研磨的目的是什么？破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中2.上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質(zhì)？可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)3.攪拌時(shí)應(yīng)輕緩、并沿一個(gè)方向原因是什么？減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子DNA的粗提取和鑒定4.若提取出的不是白色絲狀物，說明什么？觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多5.二苯胺試劑鑒定如果未呈現(xiàn)藍(lán)色說明什么？二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)了失誤等02基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性（1）啟動子：（2）終止子：位于基因的“上游”，有RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)，控制轉(zhuǎn)錄的開始位于基因末端，當(dāng)RNA聚合酶到達(dá)時(shí)，釋放出RNA產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄結(jié)束1.真核、原核基因的結(jié)構(gòu)基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性3.編碼序列（1）原核基因中編碼蛋白質(zhì)的序列是連續(xù)的（2）真核基因中編碼蛋白質(zhì)的序列是不連續(xù)的。編碼蛋白質(zhì)的序列稱為外顯子，外顯子之間不能編碼蛋白質(zhì)的序列稱為內(nèi)含子不同基因的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目及長度是不同的基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性（3）真核基因和原核基因的表達(dá)真核基因的外顯子和內(nèi)含子均會被轉(zhuǎn)錄真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄形成的RNA需要經(jīng)過加工（切去內(nèi)含子對應(yīng)的部位），才可用于翻譯原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄形成的RNA，不需要加工，可直接用于翻譯基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性2.獲取目的基因（基因工程的基本操作）（1）目的基因：人們感興趣、想研究的基因，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，如：人的胰島素基因、植物的抗病基因等目的基因“殺蟲基因”—Bt抗蟲蛋白基因基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性（2）獲取方法通過化學(xué)方法直接人工合成目的基因要求：a.基因比較小

b.核苷酸序列已知的基因通過構(gòu)建基因文庫獲取目的基因基因文庫種類：①基因組文庫（包含一種生物的所有基因）

②部分基因文庫（只包含一種生物的部分基因cDNA文庫）DNA合成儀基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性拓展：基因文庫的構(gòu)建過程某生物體全部DNA許多DNA片段受體菌群體限制酶與載體連接、導(dǎo)入受體菌群體cDNA某生物體發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA逆轉(zhuǎn)錄與載體連接、導(dǎo)入基因組文庫cDNA文庫基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性真核細(xì)胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動子終止子基因不含非編碼序列即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫

基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少

物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性③

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR技術(shù)）a.原理：原理：DNA的半保留復(fù)制（在體外大量復(fù)制目的基因的核苷酸序列）b.原料：DNA模版、引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶c.優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、靈敏d.應(yīng)用：醫(yī)學(xué)鑒定、法醫(yī)鑒定、古生物學(xué)研究前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性e.過程5’3’3’5’3’5’5’3’

變性雙螺旋解開變性：當(dāng)溫度超過90℃時(shí)，雙鏈DNA解旋為單鏈基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性復(fù)性：溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合5’3’3’5’復(fù)性3’5’兩種引物3’5’注意：復(fù)性溫度過高會破壞引物與模板堿基互補(bǔ)配對

復(fù)性溫度過低，會造成引物與模板結(jié)合位點(diǎn)增加，導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈5’3’3’5’延伸3’5’3’5’5’3’3’5’基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性3’5’3’5’5’3’3’5’第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性f.結(jié)果與鑒定①結(jié)果：重復(fù)循環(huán)多次，每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）②鑒定：電泳技術(shù)（分離、鑒定、純化核酸和蛋白質(zhì)的常用方法）電泳是指帶電粒子在電場作用下，向與其攜帶電荷相反的電極遷移的過程。不同帶電粒子因分子大小、形狀、所帶電荷等因素不同，遷移速率也會有所差異?；蚬こ痰囊幌盗胁僮骺墒股铽@得新的遺傳特性核酸帶負(fù)電（含磷酸基團(tuán)），其移動速率主要受核酸片段長度的影響。在電場強(qiáng)度一定時(shí)，核酸分子越大，向正極移遷速率越慢。電泳時(shí)常使用凝膠作為介質(zhì)，凝膠的孔隙可起到分子篩的作用；凝膠浸沒于電泳緩沖液中。電泳緩沖液的作用是在電泳過程中維持合適的PH，并使溶液具有一定的導(dǎo)電性，利于核酸遷移。每個(gè)條帶包含的DNA片段長度是相同的亞甲基藍(lán)將DNA染成藍(lán)色DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物——作為參照物基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性凝膠電泳原理與結(jié)果圖課堂小結(jié)DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果DNA鑒定DNA析出去除雜質(zhì)，粗提取DNA含有DNA的試管溶液變藍(lán)取材、研磨DNA、蛋白質(zhì)等在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同獲取目的基因利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因通過構(gòu)建基因文庫獲取目的基因利用化學(xué)方法人工合成目的基因基因工程賦予生物新的遺傳特性課堂練習(xí)1.下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)”的敘述，錯誤的是(

)A.酵母和菜花均可作為提取DNA的材料B.在探究洗滌劑對植物DNA提取的影響實(shí)驗(yàn)中，自變量是DNA的提取量C.向DNA溶液中加入二苯胺試劑后用沸水浴加熱，冷卻后溶液變藍(lán)D.向上清液中加入預(yù)冷的酒精的目的是除去DNA中的雜質(zhì)，純化DNA解析：酵母和菜花含有DNA,都可以作為提取DNA的材料,A正確;在探究洗滌劑對植物DNA提取的影響實(shí)驗(yàn)中,自變量是洗滌劑的有無,B錯誤;在一定溫度下,DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色,C正確;DNA不溶于酒精,但某些物質(zhì)可以溶于酒精,利用這一原理,可以進(jìn)一步純化DNA,D正確。B解析：DNA可與Na+形成DNA鈉鹽，DNA鈉鹽不溶于酒精，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)能溶于酒精，可用酒精將DNA與蛋白質(zhì)等初步分離，加入溶液甲后獲得白色絲狀物主要為DNA，故溶液甲為體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精，A錯誤；溶液乙為二苯胺試劑，使用時(shí)需要進(jìn)行沸水浴加熱，B錯誤；豬為哺乳動物，其成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，DNA含量少，故豬血不適合用作此實(shí)驗(yàn)的材料，C錯誤；粗提取的DNA中含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)，D正確。2.某實(shí)驗(yàn)小組進(jìn)行了“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)流程如圖所示。下列說法正確的是(

)A.溶液甲是NaCl溶液，加入它的目的是溶解DNAB.溶液乙在使用時(shí)需用50~60℃水浴加熱5minC.實(shí)驗(yàn)也可用雞血、豬血等動物組織作為材料D.粗提取的DNA中含有RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)D3.如圖表示基因工程中獲取水稻某目的基因的不同方法。下列相關(guān)敘述正確的是(

)A.這三種方法都用到了酶，都是在體外進(jìn)行的B.①②③堿基對的排列順序均相同C.圖示a、b三種方法均屬人工合成法D.方法a不遵循中心法則解析：這三種方法都是在體外進(jìn)行的，且都用到了酶，方法a需要逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，方法b需要限制酶，方法c需要DNA聚合酶，A正確；方法a得到的目的基因中不含有內(nèi)含子、啟動子、終止子等調(diào)控序列，因此①②③堿基對的排列順序不都相同，B錯誤;圖示方法a和c屬于人工合成法，而方法b是從供體細(xì)胞的DNA中直接分