第六章酶工程制藥第五節(jié)酶工程的研究現(xiàn)狀一、酶基因工程生產(chǎn)酶三、進(jìn)化酶四、抗體酶人工模擬酶指根據(jù)酶的作用原理，用各種方法人為制造的具有酶性質(zhì)的催化劑，簡(jiǎn)稱人工酶或模擬酶。酶容易受到多種物理、化學(xué)因素的影響而失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑。研究模擬酶主要是為了解決酶的以上缺點(diǎn)。

肽酶就是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽半合成酶以天然酶為母體，用化學(xué)方法或基因工程方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)，從而形成一種新的人工酶分子印跡的*原理

當(dāng)模板分子與帶有官能團(tuán)的單體分子接觸時(shí)，會(huì)盡可能同單體官能團(tuán)形成多重作用點(diǎn)，待聚合后，這種作用就會(huì)被固定下來(lái)，當(dāng)模板分子被除去后，聚合物中就形成了與模板分子在空間上互補(bǔ)的具有多重作用位點(diǎn)的結(jié)合部位，這樣的結(jié)合部位對(duì)模板分子可產(chǎn)生多重相互作用，因而對(duì)此模板分子具有特異性結(jié)合能力。過(guò)程：A.印跡分子與功能單體互補(bǔ)，形成印跡分子-功能單體復(fù)合物；B.用膠聯(lián)劑在印跡分子-功能單體復(fù)合物周圍發(fā)生聚合反應(yīng)，形成交聯(lián)的復(fù)合物；C.從聚合物中除去印跡分子，得到對(duì)印跡分子具有選擇性的聚合物。印跡分子與單體相互作用的類型共價(jià)分子印跡非共價(jià)分子印跡分子印記酶分子印跡酶的設(shè)計(jì)所選擇的印跡分子主要有底物、底物類似物、酶抑制劑、過(guò)渡態(tài)類似物和產(chǎn)物等生物印跡酶生物印跡是分子印跡的一種形式，它是以天然的生物材料為骨架，在其上進(jìn)行分子印跡而產(chǎn)生對(duì)印跡分子具有特異性識(shí)別空腔的過(guò)程。五、酶的化學(xué)修飾1.酶化學(xué)修飾的概念：在較溫和的條件下，以可控制的方式使一種酶同某些化學(xué)試劑起特異性的反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或其功能基團(tuán)發(fā)生共價(jià)的化學(xué)改變一、酶化學(xué)修飾2.酶化學(xué)修飾的目的：a.提高生物活性賴?yán)i天天天天甘異賴?yán)i天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS胰蛋白酶活性中心b.增強(qiáng)在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性c.針對(duì)異體反應(yīng)，降低生物識(shí)別能力二、化學(xué)修飾的方法化學(xué)修飾方法的幾個(gè)問(wèn)題對(duì)酶性質(zhì)的了解：活性部位、穩(wěn)定條件、反應(yīng)最佳條件及側(cè)鏈基團(tuán)性質(zhì)等；選擇修飾劑考慮：1）分子量、修飾劑鏈長(zhǎng)和對(duì)蛋白吸附性；2）修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置；3）修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法和條件（一般要求較大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有較多反應(yīng)活性基團(tuán)）；選擇酶反應(yīng)條件要注意：1）反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、PH、溫度、時(shí)間；2）酶與修飾劑的比例。酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的常用修飾賴氨酸氨基的烷基化（鹵代乙酸等）；具有兩個(gè)臨位羰基的化合物修飾精氨酸胍基（丁二酮等）；烷基化試劑修飾巰基；碘代乙酸修飾組氨酸咪唑基；還有色氨酸吲哆基、甲硫氨酸甲硫基、酚基、脂肪族羥基等；二硫鍵的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾

應(yīng)用較多的修飾方法1.酶的表面化學(xué)修飾

(1)大分子修飾：可溶性大分子，其中相對(duì)分子量在500-20000范圍內(nèi)的PEG類修飾劑應(yīng)用最廣，既能溶于水，又溶于大多數(shù)的有機(jī)溶劑，化學(xué)修飾時(shí)多采用單甲氧基聚乙二醇（MPEG)(2)小分子修飾：利用小分子化合物對(duì)酶的活性部位或活性部位之外的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，以改變酶學(xué)性質(zhì)。已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖，乙酸酐，硬脂酸，鄰苯二酸酐等。(3)交聯(lián)修飾：使用雙功能基團(tuán)試劑如戊二醛，PEG等將酶蛋白分子之間，亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分間進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，可使酶分子活性結(jié)構(gòu)加固，并可提高其穩(wěn)定性，增加了酶在非水溶液中的使用價(jià)值。(4)固定化修飾：通過(guò)酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上后，由于酶所處的微環(huán)境的改變，會(huì)使酶的性質(zhì)（最適ph，最適溫度，穩(wěn)定性等）改變。2.酶分子內(nèi)部修飾3.結(jié)合定點(diǎn)突變的化學(xué)修飾在醫(yī)藥方面：克服酶在體內(nèi)的不穩(wěn)定性消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到達(dá)并集中于病灶細(xì)胞在酶結(jié)構(gòu)功能研究中：研究酶空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，如酶的活性中心研究；確定氨基酸殘基的功能；測(cè)定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量在工業(yè)領(lǐng)域：化學(xué)修飾酶能夠提高酶對(duì)熱、酸、堿和有機(jī)溶劑的耐性，改變酶的底物專一性和最適ph等酶學(xué)性質(zhì)。酶蛋白化學(xué)修飾的局限性1.專一性是相對(duì)的2.化學(xué)修飾后酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變3.只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行4.因此化學(xué)修飾法研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚缺乏準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性。第六節(jié)酶工程在制藥工業(yè)中的應(yīng)用3132固定化酶產(chǎn)品介紹氨基?；福哼@是世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶，可以用于生產(chǎn)各種L-氨基酸藥物。1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基?；福肈EAE-葡聚糖凝膠為載體通過(guò)離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，將L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用來(lái)拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸經(jīng)過(guò)消旋化，生成DL-乙酰氨基酸．再進(jìn)行拆分。生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60％左右。33固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸乙酰-DL－Ala

L－Ala+乙酰-D－AlaAminoacylase氨基?；?4泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子DEAE-葡聚糖－氨基?；妇wL-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala35(2)天門冬氨酸酶：1973年日本用聚丙烯酰胺凝膠為載體，將具有高活力天門冬氨酸酶的大腸桿菌菌體包埋制成固定化天門冬氨酸酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)，將延胡索酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天門冬氨酸。1978年以后，改用角叉菜膠為載體制備固定化酶，也可將天門冬氨酸酶從大腸桿菌細(xì)胞中提取分離出來(lái)，再用離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)。36(3)天門冬氨酸脫羧酶：將含天門冬氨酸脫羧酶的假單胞菌菌體，用凝膠包埋法制成固定化天門冬氨酸脫羧酶，于1982年用于工業(yè)化生產(chǎn)，催化L-天門冬氨酸脫去羧基，生產(chǎn)L-丙氨酸。37(4)青霉素酰化酶：是在藥物生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的一種固定化酶?？捎枚喾N方法固定化。1973年已用于工業(yè)化生產(chǎn)，用于制造各種半合成青霉素和頭孢菌素。用同一種固定化青霉素酰化酶，只要改變pH等條件，就既可以催化青霉素或頭孢菌素水解生成6一氨基青霉烷酸(6一APA)或7一氨基頭孢霉烷酸(7一ACA)，也可以催化6一APA或7一ACA與其他的羧酸衍生物進(jìn)行反應(yīng)，以合成新的具有不同側(cè)鏈基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素。38固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素酰化酶與抗生素改造394041E.Coli斜面細(xì)胞固定化細(xì)胞青霉素G轉(zhuǎn)化液