第四章免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)（或生物）發(fā)光劑等作為示蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，并籍助于熒光顯微鏡、射線測(cè)量?jī)x、酶標(biāo)檢測(cè)儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定，可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定。原位雜交共聚焦顯微鏡原位雜交照片第一節(jié)免疫熒光技術(shù)一、經(jīng)典的免疫熒光技術(shù)二、現(xiàn)代免疫熒光分析技術(shù)一、經(jīng)典的免疫熒光技術(shù)基本原理：免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合。以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體（或抗原，較少用）結(jié)合，但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定未知的抗原。免疫熒光標(biāo)記技術(shù)（一）熒光抗體的制備1、抗體2、熒光及熒光素3、熒光素標(biāo)記抗體的方法4、標(biāo)記抗體的純化與質(zhì)量鑒定5、標(biāo)記抗體的保存1、抗體用于制備熒光素結(jié)合的抗體要求特異性強(qiáng)，純度高，效價(jià)滿意，瓊脂雙向擴(kuò)散效價(jià)不低于1：32（稀釋抗體）或環(huán)狀沉淀試驗(yàn)效價(jià)高于1：4000（稀釋抗原）。2、熒光及熒光素適用于抗體標(biāo)記的熒光素須具備以下條件：（1）應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定共價(jià)鍵結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，或易于轉(zhuǎn)變成此類基團(tuán)而不破壞其熒光結(jié)構(gòu)（2）熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合的需要能量很少。（3）與抗體或抗原結(jié)合后，應(yīng)不影響其免疫學(xué)特異性。（4）結(jié)合物產(chǎn)生的熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光對(duì)比鮮明，能清晰地判斷。（5）熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡(jiǎn)便、快速、游離的熒光素及其降解產(chǎn)物容易去除。此外，結(jié)合物在一般貯存條件下性能穩(wěn)定，可保存使用較長(zhǎng)時(shí)間。目前用于標(biāo)記抗體的熒光素主要有——異硫氰酸熒光黃（FITC）——四乙基羅丹明（RB200）——四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）。3、熒光素標(biāo)記抗體的方法FITC標(biāo)記法：分為直接標(biāo)記法和半透膜滲透標(biāo)記法。直接標(biāo)記法A．取適量提純的IgG，用生理鹽水和0.5mol/L、pH9.5碳酸鹽緩沖液（9：1）稀釋為20mg/mL。將容器放置冰浴內(nèi)；B．按每mg抗體蛋白內(nèi)加入0.01~0.02mgFITC（即二者比例為1：50~1：100）。用分析天平稱取所需量的FITC，先溶解于少量碳酸鹽緩沖液（同上），再逐滴緩慢加入蛋白液內(nèi)。邊加邊攪拌混勻，避免產(chǎn)生氣泡，約在5~10分鐘內(nèi)加完；C．將容器（瓶口加塞密閉）及電磁攪拌器移置4~6℃冰箱內(nèi)，繼續(xù)緩慢攪拌結(jié)合12~18小時(shí)（亦可在20~25℃室溫下攪拌結(jié)合2~4小時(shí)）。去除游離熒光素：先將結(jié)合物經(jīng)離心沉淀（3000r/min，20分鐘）除去少量沉淀物，取上清置透析袋內(nèi)，用0.01mol/L、pH7.2磷酸緩沖液（PBS）于4℃透析3~5天（PBS液量應(yīng)為結(jié)合物的100倍，并需多次更換透析液）。或?qū)⒔Y(jié)合物通過(guò)SephadexG-50凝膠柱層析，收集第1洗脫峰，合并，即為熒光抗體。4、標(biāo)記抗體的純化與質(zhì)量鑒定標(biāo)記抗體的純化——游離熒光素的去除——未標(biāo)記及過(guò)度標(biāo)記蛋白的去除——非期望抗體或交叉反應(yīng)抗體的去除4、標(biāo)記抗體的純化與質(zhì)量鑒定標(biāo)記抗體的鑒定——抗體效價(jià)——熒光素（F）與蛋白質(zhì)（P）結(jié)合比率（F/P值）4、標(biāo)記抗體的純化與質(zhì)量鑒定特異性染色滴度測(cè)定——直接法——間接法標(biāo)記抗體的特異性鑒定——吸收試驗(yàn)——抑制試驗(yàn)5、標(biāo)記抗體的保存經(jīng)鑒定合格的熒光抗體，可加入0.01%硫柳汞或0.1%疊氮鈉防腐，小量分裝(0.5mL/安瓿)，置0~4℃可保存1年左右；-20℃可保存2~3年，但取出后應(yīng)快速融化，并避免反復(fù)凍融。冰凍干燥后可保存較長(zhǎng)時(shí)間。（二）熒光抗體染色方法用途：測(cè)定細(xì)胞表面抗原和受體各種病原微生物的快速檢查和鑒定組織內(nèi)抗原的定性和定位研究各種自身抗體的檢測(cè)（二）熒光抗體染色方法標(biāo)本來(lái)源穿刺液體液、胸腹水、尿液培養(yǎng)細(xì)胞活體組織取材（二）熒光抗體染色方法標(biāo)本保存選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┗铙w組織選擇適當(dāng)?shù)那衅椒ǎǘ晒饪贵w染色方法直接法間接法二、現(xiàn)代免疫熒光分析技術(shù)（一）熒光偏振免疫分析法（二） 均相熒光免疫測(cè)定（三） 熒光激活細(xì)胞分類儀（四） 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定熒光與發(fā)光免疫分析第二節(jié)放射免疫技術(shù)一、放射免疫測(cè)定（RIA）二、免疫放射測(cè)定（IRMA）三、放射受體分析主要材料和試劑標(biāo)記抗原標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品特異性抗體分離劑γ-計(jì)數(shù)儀低溫離心機(jī)標(biāo)記抗原制備——氯胺T法標(biāo)記抗原制備——乳過(guò)氧化物酶法標(biāo)記抗原制備——氯甘脲法測(cè)定方法——胰島素含量的測(cè)定二、免疫放射測(cè)定測(cè)定方法直接IRMA法雙抗體夾心IRMA法間接IRMA法BAS-IRMA法測(cè)定方法——雙抗體夾心IRMA法第三節(jié)免疫酶技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)免疫酶技術(shù){均相酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定{非均相酶免疫測(cè)定

非均相酶免疫測(cè)定{固相酶免疫測(cè)定（ELISA）液相酶免疫測(cè)定HRP追蹤技術(shù)免疫組織化學(xué)染色一、酶標(biāo)抗體的制備用于標(biāo)記抗體（或抗原）的酶應(yīng)符合下列要求——純度及比活性高，且價(jià)廉易得——性質(zhì)穩(wěn)定，可溶性好；而且容易和抗體（或抗原）連接，二者的活性均不受影響——受檢組織或體液中不存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或抑制物；——檢測(cè)方法簡(jiǎn)易、敏感、精確——酶的底物對(duì)人體健康無(wú)危害常用的標(biāo)記酶辣根過(guò)氧化物酶堿性磷酸酶葡萄糖氧化酶β-D半乳糖苷酶二、非均相酶免疫測(cè)定（一）固相酶免疫測(cè)定（二）液相酶免疫測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（一）固相酶免疫測(cè)定——間接法（一）固相酶免疫測(cè)定——雙抗體夾心法