ICS65.020DB22CCSB05吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T3455—2023分蘗洋蔥中洋蔥黃矮病毒檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法Detectionofonionyellowdwarfvirusbyreal-timePCRonShallot吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3455—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》和GB/T20001.4—2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則第4部分：化學(xué)分析方法》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：李小宇、張春雨、王海鵬、王永志、蘇穎、李建平、張金花、楊陽(yáng)、于紅。IDBXX/XXXXX—XXXX分蘗洋蔥中洋蔥黃矮病毒檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法警告─使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問(wèn)題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。1范圍本文件描述了分蘗洋蔥中洋蔥黃矮病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本文件適用于分蘗洋蔥中洋蔥黃矮病毒的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)中文的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件的必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅注日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T28067甘蔗黃葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法比對(duì)洋蔥黃矮病毒外殼蛋白基因，設(shè)計(jì)一對(duì)僅在洋蔥黃矮病毒外殼蛋白基因間保守的特異性引物。提取分蘗洋蔥總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板，利用Taq酶進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)（采用SYBRGreenⅠ熒光染料方法）。SYBRGreenⅠ是一種具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，能夠與雙鏈DNA小溝區(qū)域結(jié)合。游離狀態(tài)的SYBRGreenⅠ只發(fā)出微弱的熒光，當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光強(qiáng)度會(huì)顯著增加，而且熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。1DBXX/XXXXX—XXXX5.1.7異丙醇。5.1.8無(wú)水乙醇。5.1.9DEPC處理的水。5.1.10DEPC處理的75%乙醇：無(wú)水乙醇（含量≥99.8%）與DEPC處理的水按3︰1的體積比配置。5.2引物5.2.1引物序列上游引物：5′-GCACGTTACGCATTCGACTT-3′下游引物：5′-GCCTTCATCTGCATGTGTG-3′5.2.2引物配制引物用水稀釋成10μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?儀器設(shè)備6.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。6.2核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。6.3電子天平：感量0.01g。6.4高速冷凍離心機(jī)：離心力12000g以上。6.5微量移液器：0.1μL～2.5μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。6.6恒溫水浴鍋。用已知不含有洋蔥黃矮病毒的新鮮管狀葉作為陰性樣品。7.2試樣采集新鮮管狀葉為宜，也可采集地下鱗莖。裝入密封袋，置于冰盒中，4℃保存不超過(guò)12h，也可-80℃長(zhǎng)期保存。8.1RNA提取2DBXX/XXXXX—XXXX8.1.18.1.2離心管、藥匙等經(jīng)液氮預(yù)冷。稱(chēng)取0.1g樣品液氮充分研磨（檢測(cè)鱗莖時(shí)，選擇中部層取樣。），轉(zhuǎn)入0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）處理的1.5mL離心管中，立即加1mLTrizol試劑，混勻，室溫裂解5min。8.1.3加200μL氯仿，充分搖晃混勻15s，室溫靜置2min～3min，4℃12000r/min離心15min，取上層溶液轉(zhuǎn)入新的DEPC處理的1.5mL離心管中。8.1.4加0.5mL異丙醇，混勻，室溫靜置10min，4℃12000r/min離心10min，棄上清。8.1.5加1mLDEPC處理的75%乙醇，渦旋震蕩1min，4℃12000r/min離心5min，棄上清。8.1.6離心管開(kāi)蓋晾5min～10min至管壁和管蓋無(wú)液體，加入40μLDEPC水，混勻溶解，直接進(jìn)行下步操作或-80℃保存?zhèn)溆谩?.1.7用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA濃度。8.2反轉(zhuǎn)錄8.2.1利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系見(jiàn)表1、表2。表1反應(yīng)體系-1體積試劑μL隨機(jī)的6核苷酸引物dNTP混合溶液(10mmol/L)模板RNA11體積上述變性后反應(yīng)液5×PrimeScriptⅡBufferrnaseinhibitor(40U/μL)primeScriptⅡRTase(200U/μL)rnasefreeddH2O8.2.2.1反應(yīng)體系-1，65℃溫浴5min，冰浴冷卻備用。8.2.2.2反應(yīng)體系-2，30℃10min后42℃1h。3DBXX/XXXXX—XXXX表3反應(yīng)體系試劑劑量μL終濃度2×MagicSYBRMixtrue上游引物（10μM）下游引物（10μM）cDNA101×0.3μM0.60.620.3μM10ng～200ngddH2O補(bǔ)齊至208.3.2反應(yīng)程序預(yù)變性95℃5min，變性95℃30s，退火延伸60℃15s，40個(gè)循環(huán)。9試數(shù)據(jù)處理9.1結(jié)果分析條件設(shè)定讀取檢測(cè)結(jié)果，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果呈陰性為準(zhǔn)。9.2檢測(cè)結(jié)果的判定根據(jù)Ct值判定檢測(cè)結(jié)果，在陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期一致的前提下：b)檢測(cè)樣品的Ct值介于35～40，且出現(xiàn)特定