ICS11.220DB13B43河北省地方標準DB13/T2892—2018禽白色念珠菌病綜合診斷技術(shù)規(guī)程河北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB13/T2892—2018前言本標準按照GB/T1.1－2009給出的規(guī)則起草。本標準由河北工程大學(xué)提出。本標準起草單位：河北工程大學(xué)。本標準主要起草人：劉建釵、柳煥章、趙振宇、劉娜、張鶴平、姬國強、李聚芹、喬鐵庫、劉彥威、劉艷莉、張良、董改琳、薛素琴、孫冰玉。IDB13/T2892—2018禽白色念珠菌病綜合診斷技術(shù)規(guī)程12范圍本標準規(guī)定了禽白色念珠菌病綜合診斷技術(shù)的臨床診斷、實驗室診斷和綜合判定。本標準適用于雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等禽類白色念珠菌病的診斷及其白色念珠菌病原的檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489-2008實驗室生物安全通用要求3縮略語下列縮略語適用于本文件。GMA-Grocott：六胺銀染色PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)PDA：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PAS：過碘酸雪夫氏染色SYBRGreenⅠ：DNA熒光染料TTC：紅四氮唑顯色培養(yǎng)基TSA：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基YEPD：酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基4各日齡禽均可感染，雛禽易感。病禽嗉囊腫脹，觸感松軟，內(nèi)容物或口水氣味酸臭；在喙、口腔、舌有潰瘍灶或偽膜；糞便常伴有未充分消化的飼料；個別病禽有皮膚結(jié)痂或脫毛、眼部感染等癥狀。在口腔、咽喉、食道、嗦囊和腺胃等消化道黏膜上有乳白色斑片、潰瘍或鱗屑狀病變；嚴重者嗉囊阻塞充血、腺胃壁增厚、肌胃內(nèi)膜糜爛，肝臟淤血或有出血斑、壞死灶，脾、腎腫大明顯，表面白色壞死灶。51DB13/T2892—20185.1常規(guī)檢測5.1.1樣品的采集取病禽嗉囊、肝臟、腎等病料，放入無菌的平皿中，剪開嗉囊，用拭子擦拭嗉囊內(nèi)表面，放入1.5mL滅菌EP管中備用；其他器官用無菌剪刀各取小塊組織兩份，用滅菌水充分沖洗后，一份接種于YEPD平板上（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉），一份放入40g/L甲醛固定液中待用。5.1.2病原菌的分離純化與形態(tài)觀察將接種病料的平板放入培養(yǎng)箱，28℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況；3d后用接種環(huán)挑取平板上的疑似菌落，劃線接種于YEPD平板培養(yǎng)基繼續(xù)分離培養(yǎng)，3d后將疑似單菌落進行涂片、染色和鏡檢，取酵母狀細胞的對應(yīng)菌落菌體進一步接種于PDA試管斜面，28℃培養(yǎng)3d后保存?zhèn)溆谩φ瞻咨钪榫湫途湫螒B(tài)和菌體形態(tài)特征進行初步鑒別,參見附錄A,。5.1.3顯色培養(yǎng)鑒別用接種環(huán)挑取疑似菌株的菌體，分別劃線接種或稀釋后涂布于TTC和CHROMagarCandida顯色培養(yǎng)基平板的劃定區(qū)域，如兩者均呈現(xiàn)白色念珠菌特征性色澤即可初步診斷為陽性,參見附錄A。5.1.4組織切片檢查將40g/L甲醛固定液中樣本固定24h后取出，經(jīng)修塊、脫水、透明、浸蠟包埋、切片、HE染色、PAS和GMA染色，顯微鏡觀察組織病理和病原生長情況,參見附錄A。以病料中檢查到菌絲或孢子為陽性結(jié)果，病料中連續(xù)兩次檢查不到菌絲和孢子為陰性。選擇有典型癥狀的病禽，無菌采血或病變組織（肝、脾），放入1.5mL滅菌EP管中，將EP管編號，記錄樣本信息，-20℃保存?zhèn)溆?。取組織樣本0.2g放在研缽中，加入適量液氮，待液氮即將揮發(fā)殆盡時迅速研磨成粉末狀，收集樣本0.05g～0.1g于1.5mLEP管中，加入500μL裂解液（400mMTris-HCl[pH8.0]，60mMEDTA[pH8.0]，150mMNaCl，1%sodiumdodecylsulfate），室溫放置10min；加150μL乙酸鉀(pH4.8)，漩渦震蕩，離心12000g，1min，取上清液放入新試管，加入等體積異丙醇；DNA團塊用70%乙醇清洗，干燥后，溶解在50μLTE（10mMTris，1mMEDTA）中保存。參照GenBank已發(fā)表的白念珠菌rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列，采用PrimerExpress6.0軟件設(shè)計一對特異引物（預(yù)期擴增片段大小273bp）：采用25μL的反應(yīng)體系：SYBRPremixExTaq（2×）12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模2DB13/T2892—2018板1.0μL，用雙蒸水補足至25μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃10s，60℃30s，72℃30s，進行35個循環(huán)。5.2.5標準曲線和熔解曲線從白色念珠菌10見，在10～10copies/μL濃度范圍內(nèi)熒光曲線呈“S”形。以線性范圍內(nèi)6個濃度（10的特異性克隆為模板在同樣條件下進行SYBRGreenqPCR反應(yīng)，得到標準曲線和熔解曲線。6～100copies/μL一系列模板特異性克隆的SYBRGreenⅠqPCR反應(yīng)熒光曲線可6161～10copies/μL）5.2.6結(jié)果判斷當(dāng)待測樣品實時熒光定量PCR檢測結(jié)果有“S”型擴增曲線，Ct值≤36.5，且Tm值為85℃時，判定待測樣品中含有白色念珠菌，而且可通過Ct值大小判斷感染的程度可參見附錄A。未出現(xiàn)“S”型擴增曲線和Tm值，則判斷樣品中不含白色念珠菌。6綜合判定結(jié)合臨床診斷、實驗室檢測結(jié)果，可確診禽白色念珠菌病。3DB13/T2892—2018附錄A(資料性附錄)菌落形態(tài)和菌絲及孢子形態(tài)特征A.1鏡檢將每個取樣EP管封蓋，瞬時振蕩，用無菌棉簽沾取懸液于YEPD慶大霉素培養(yǎng)基平板涂劃接種，于28℃恒溫培養(yǎng)36h～48h；將疑似單菌落取菌體經(jīng)革蘭氏染色和棉藍染色鏡檢，將革蘭氏陽性反應(yīng)且為酵母狀細胞的相應(yīng)菌落取菌體分別接種于沙保弱培養(yǎng)基平板、玉米粉吐溫瓊脂培養(yǎng)基平板、TSA血液培養(yǎng)基平板和無菌載片，于28℃恒溫、保濕培養(yǎng)3d～4d，觀察平板菌落特征并直接鏡檢載片培養(yǎng)物形態(tài)特征。A.2判斷沙保弱培養(yǎng)基平板上可見灰白色、光滑的細小菌落，3d可見菌落增大、隆起，邊緣齊整，乳白色潤澤狀，5d菌落密集部位長出菌絲；TSA血液培養(yǎng)基平板上菌落生長較快，4d可見菌落邊緣與基質(zhì)內(nèi)部有大量絲狀菌體出現(xiàn)；玉米粉吐溫瓊脂培養(yǎng)基平板上菌落生長較慢，6d可見菌落邊緣與基質(zhì)內(nèi)部有大量絲狀菌體出現(xiàn)。革蘭氏染色和棉藍染色見菌體大小不等，且可見分隔菌絲。直接鏡檢載片培養(yǎng)物可見菌絲（芽管）、厚垣孢子。將同時看到菌絲狀菌落、菌絲（芽管）、厚垣孢子形態(tài)者記錄為陽性結(jié)果。用接種環(huán)挑取疑似菌株的菌體分別劃線接種于兩種顯色培養(yǎng)基平板的劃定區(qū)域，在同一平板的相鄰區(qū)域分別接種已知白色念珠菌作對照；也可將疑似菌