ICS11.220DB21B41遼寧省地方標準DB21/T3094—2018種豬場歐洲型豬藍耳病凈化技術規(guī)范Thetechnicalspecificationsforremovingeuropeangenotypeporcinereproductiveandrespiratorysyndromeinbreedingpigfarm遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3094—2018目次前1言............................................................................II范圍..............................................................................1規(guī)范性引用文件....................................................................1術語和定義........................................................................1233.1歐洲型豬藍耳病................................................................1可疑感染豬群..................................................................1假定健康豬群..................................................................13.23.345凈化群的建立......................................................................14.1采樣數量和采樣時間............................................................1檢測方法......................................................................2處理..........................................................................34.24.3凈化群的維持......................................................................45.1日常檢測......................................................................4后備豬的檢測..................................................................4引進豬只的檢疫................................................................4病死豬的檢測..................................................................467凈化場的認定......................................................................4凈化場的維持......................................................................4引進豬只的檢疫................................................................4病死豬的檢測..................................................................4人員和車輛等物品的消毒........................................................4場內及舍內環(huán)境的消毒..........................................................5無害化處理措施................................................................5殺蟲防蠅滅鼠措施..............................................................5附錄A（規(guī)范性附錄）附錄A..........................................................6IDB21/T3094—2018前言本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則并起草。本標準由遼寧省畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。本標準起草單位：錦州醫(yī)科大學、遼寧省動物衛(wèi)生監(jiān)測預警中心、錦州市動物疫病預防控制中心等單位。本標準主要起草人：李冰、劉全、高慎陽、劉英姿、陳勇、李寧、張建平、馬強、趙巖、田苗、張娜、夏偉、邵奎龍、路暢、李紅偉、郭雪峰、孫洪廣、劉宏艷、李強、劉曉宇、王軍、徐暢、何禮。IIDB21/T3094—2018種豬場歐洲型豬藍耳病凈化技術規(guī)范1范圍本標準規(guī)定了種豬場歐洲型豬藍耳病凈化的術語和定義、檢測方法與判定標準、凈化群的建立、凈化群的維持、凈化場的認定和凈化場的維持。本標準適用于種豬場歐洲型豬藍耳病凈化工作。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T27517GB/T6682GB16548鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經典毒株復合RT-PCR方法分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法病害動物和病害動物產品生物安全處理規(guī)程畜禽糞便無害化處理技術規(guī)范NY/T11683歐洲型豬藍耳?。‥uropeanGenotypePorcineReproductiveandRespiratorySyndrome；EU-PRRS）：由歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起豬的一種高度接觸性傳染病，該病不但引起豬只免疫抑制，母豬流產，也可引起仔豬死亡，同時影響高致病性豬藍耳病的防控工作，是世界上危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一?？梢筛腥矩i群（Suspiciouslyinfectedswineherd）：未發(fā)現(xiàn)任何癥狀，但與患病豬群及其污染假定健康豬群（Hypothesisofhealthyswineherd）：除了患病豬群和可疑感染豬群外，疫區(qū)其41DB21/T3094—2018種公豬按100%比例采血，或同時按100%比例采集精液，連續(xù)采集2次，間隔14天。種母豬按25%比例采血，或同時采集活體扁桃體，連續(xù)采集2次，間隔14天。4.1.2可疑感染豬群種公豬、種母豬分別按100%比例采血，或同時按100%比例采集精液，連續(xù)采集2次，間隔14天。4.1.3感染豬群種公豬、種母豬、后備豬分別按100%比例采血，或同時按100%比例采集精液，連續(xù)采集2次，間隔14天。4.2檢測方法4.2.1檢測試劑和儀器本技術規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所用試劑均為分析純；所有試劑均用無RNA酶的容器分裝，水為符合GB/T6682-1992標準的滅菌雙蒸水或超純水。本技術規(guī)范中需應用下列試劑和材料：Trizol（RNA抽提試劑，外觀為粉紅色，分裝至棕色瓶中，于4℃～8℃保存）、氯仿（4℃預冷）、異丙醇（4℃預冷）、75%乙醇（用新開啟的無水乙醇和DEPC水配制，－20℃預冷）、DEPC水（1000mL雙蒸水中加入1mLDEPC，室溫下持續(xù)攪拌過夜，121℃高壓滅菌25min）、RNA酶抑制劑（40U/μL）、TaqDNA聚合酶（5U/μL）、dNTP(2.5mmol/L)、AMV反轉錄酶（5U/μL）、三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（TAE）、溴化乙錠（EB）、DL2000DNAMarker、上游引物：5ˊ-TAACCGAGCATACGCTGTGAGAAAG-3ˊ，下游引物：5ˊ-CAAATTAACTTGCACCCTGACTGGC-3ˊ。本技術規(guī)范中使用的設備包括：PCR擴增儀，高速冷凍離心機（離心力在12000g以上），核酸電泳儀和水平電泳槽，組織均漿機或研缽，凝膠成像系統(tǒng)、微量移液器。4.2.2.1組織樣品：按照GB/T27517標準中關于組織樣品處理方法執(zhí)行。采集時應釆取有明顯病變的淋巴結、扁桃體、肺臟、脾臟、腎臟、胸腺等組織樣品。用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品0.5g左右于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加0.3mL～0.5mLPBS混勻，然后將組織懸液轉入無菌Eppendorf管中，4℃條件下5000r/min離心10min，取上清液轉入新的無菌Eppendorf管中，編號備用。4.2.2.2血清或抗凝血：用無菌注射器自耳靜脈或前腔靜脈釆集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸取血清至無菌Eppendorf管中，血清量不少于0.5mL，編號備用；用無菌注射器先吸入抗凝劑（阿氏液）2mL～3mL，再自耳靜脈或前腔靜脈采集等量血液快速混勻后轉入無菌Eppendorf管中，編號備用。4.2.2.3存放與運送：采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運送到實驗室。采集或處理的樣品在2℃～8℃條件下保存應不超過24h；若需長期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融。4.2.2.4RNA提取及cDNA合成：按照Trizol提取試劑說明書提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行轉錄合成cDNA，－20℃保存待檢。2DB21/T3094—2018表1RT-PCR反應體系（總體積25μL）反應體系最佳劑量13.5μL2μLDEPC水2.5mmol/LdNTP10μmol/L上游引物10μmol/L下游引物25mmol/L氯化鎂溶液10倍PCR緩沖液5U/μLTaqDNA聚合酶cDNA1μL1μL1.5μL2.5μL0.5μL3μL總體積25μL反應條件：預變性95℃3min；變性94℃30s，退火溫度58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；總延伸72℃10min。4.2.2.6電泳：將PCR擴增產物8μL與2μL上樣緩沖液混合，加樣于1%瓊脂糖凝膠孔中，瓊脂糖凝膠板一側點樣孔加入DL2000MarkDNA分子質量標準物。以5V/cm電壓電泳30min，用紫外凝膠成像儀觀察結果。4.2.2.7結果判定被檢樣品電泳出現(xiàn)519bp擴增帶為歐洲型PRRSV陽性，詳見圖1。圖1歐洲型PRRSV陽性毒株PCR電泳圖歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測陽性者，應淘汰處理。在最后1頭陽性豬淘汰后3個月，對種公豬按100%比例、母豬按25%比例采血或同時按相同比例采集活體豬扁桃體樣品，再次進行歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測。歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測全部陰性，可視為假定歐洲型豬藍耳病陰性豬群。3DB21/T3094—20185凈化群的維持日常檢測5.1每年對假定歐洲型豬藍耳病陰性種豬群進行3～4次抽檢。每次采集血清或活體扁桃體樣品，抽樣比例為存欄種豬的25%～35%。應在連續(xù)12個月內，對所有6月齡以上種豬每頭至少進行1次歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測，檢測方法按本技術規(guī)范建立的方法執(zhí)行。抽樣復查如歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測出現(xiàn)陽性，應重新對種豬群開展凈化，確保種豬群歐洲型豬藍耳病病毒核酸陰性。5.2后備豬的檢測選留的后備豬在轉入種豬群前，進行歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測，確保轉入種豬群的豬只歐洲型豬藍耳病病毒保持陰性，樣品采集、檢測方法及處置同4.1、4.2和4.3檢測方法。5.3引進豬只的檢疫對引進豬只嚴格進行檢疫、隔離，確保引進豬只沒有歐洲型豬藍耳病病毒感染和帶毒，檢疫方法按4.1、4.2和4.3執(zhí)行。5.4病死豬的檢測收集病死豬及母豬所生產的弱仔豬、死胎、流產胎兒，進行歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測，檢測方法同4.2。如若檢出歐洲型豬藍耳病病毒核酸陽性，應重新對種豬群開展凈化。6種豬場連續(xù)12個月對所有6月齡以上種豬至少進行2次病原學監(jiān)測，監(jiān)測結果為陰性。有監(jiān)測證據表明在過去12個月內豬群沒有出現(xiàn)歐洲型豬藍耳病臨床病例。7按照《跨省調運乳用、種用動物產地檢疫規(guī)程》(農醫(yī)發(fā)[2010]33號)規(guī)定引進豬只。建立專門隔離飼養(yǎng)舍，嚴格檢疫引進豬只。在種豬啟運前對擬引進豬只逐頭進行檢測，確定歐洲型豬藍耳病病毒核酸收集病死豬及母豬所生產的弱仔、死胎、流產胎兒，進行歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測，檢測若弱仔、死胎及流產胎兒按4.2方法檢測病毒核酸，檢測結果陽性者，淘汰對應的親本母豬，4DB21/T3094—2018控制人員出入，豬場門口和各豬舍門口應設立消毒池，定期更換消毒藥水；進入豬場的車輛除過消毒池消毒外，還應對車身進行噴灑消毒；飼養(yǎng)、管理等人員可采取淋浴、消毒液洗手、紫外線照射衣物等方式消毒；衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取浸泡、高壓滅菌等方式消毒；一線飼養(yǎng)人員嚴禁串舍，生產工具不得混用。7.4場內及舍內環(huán)境的消毒場內應設置凈道和污道，對場內道路和明溝可用2%的氫氧化鈉等堿性消毒劑消毒；豬舍在有豬的狀態(tài)下，要選用無刺激或刺激性小的消毒藥進行舍內環(huán)境消毒，平時預防一般1周消毒1～2次。7.5無害化處理措施病死豬及母豬所生產的死胎、流產胎兒按GB16548的要求，糞便